Pata Wright este o tehnică de colorare creată de patologul american James Homer Wright în 1902, bazată pe pata Romanowsky. Deoarece pata Romanowsky a fost instabilă, Wright a încorporat metanolul ca solvent și fixator..
Această colorare este policromatică, ceea ce înseamnă că generează mai multe culori în funcție de structura care absoarbe colorantul. Această tehnică de colorare a fost utilizată pe scară largă pentru efectuarea numărului diferit de celule albe din sânge și pentru a studia morfologia celulelor roșii din sânge, a trombocitelor și a leucocitelor din sângele periferic și măduva osoasă..
Aplicarea sa este foarte importantă, deoarece anomaliile pot fi observate în diferitele linii celulare ale sângelui, facilitând diagnosticul de boli precum leucemia sau infecțiile bacteriene sau parazitare..
Poate că acestea sunt cele mai frecvente aplicații în care se folosește această tehnică, totuși nu sunt singurele. Este, de asemenea, util în alte probe decât sângele și măduva osoasă, cum ar fi scurgerile nazale, mucusul fecal, sputa, probele de piele, printre altele..
Indice articol
Pata Wright s-a născut din pata Romanowsky, care constă dintr-o soluție de alcool metilic dintr-un colorant acid (eozină Y) și un colorant bazic (albastru de metilen) și produsele lor de oxidare..
Amestecul de coloranți utilizat în pata Wright provoacă efectul cunoscut sub numele de Romanowsky, adică oferă o frumoasă colorare purpurie nucleilor leucocitelor și granulelor neutrofile, în timp ce globulele roșii din sânge se colorează în roz..
Componentele responsabile pentru acordarea gamei de culori tipice a petei lui Wright sunt albastrul B și eozina Y. Efectul observat va depinde de legarea coloranților la structurile chimice și de interacțiunile albastrului B și eozinei Y.
Structurile acide, cum ar fi acizii nucleici, proteinele nucleare și citoplasma imatură reactivă a unor tipuri de celule, fixează albastrul B (pata de bază).
În timp ce structurile bazice, cum ar fi hemoglobina, granulele eozinofilelor segmentate, printre alte structuri celulare, leagă eozina Y (colorant acid).
Rezultatul colorării poate fi influențat de diferiți factori, cum ar fi pH-ul colorantului Wright, tamponul și soluția de spălare; precum și timpul de colorare și fixare.
Prin urmare, fiecare etapă în prepararea reactivilor este crucială și trebuie efectuată având grijă de fiecare detaliu..
Pata lui Wright. Pentru 100 ml este necesar:
Se cântăresc 0,3 g de pată Wright, se măsoară 97 ml metanol și 3 ml glicerol.
Într-un mortar, așezați cantitatea mare de pată Wright și încorporați treptat glicerina până când pulberea este complet dizolvată..
Ulterior, metanolul este adăugat, amestecat și turnat într-o sticlă de chihlimbar.
Înainte de utilizare, soluția trebuie agitată cu mișcări ușoare și filtrată.
Într-un litru de apă distilată, adăugați 3,76 g de hidrofosfat disodic (NaDouăHPO4 2HDouă0) plus 2,1 g dihidrogen fosfat de potasiu (KHDouăPO4).
Se amestecă foarte bine până se dizolvă toți reactivii încorporați. Reglați pH-ul la 7,2. Se toarnă într-un borcan de sticlă și se păstrează la temperatura camerei.
În plus, sunt necesare alte materiale pentru a putea efectua tehnica de colorare, acestea sunt: diapozitive pentru obiecte sau acoperă obiecte, pod de colorat, tricouri cu apă sau tampon pentru spălare, un cronometru pentru păstrarea timpilor de colorare și ceva material de șters. (hârtie absorbantă, tifon sau bumbac).
Alcoolul (metanolul) servește ca un remediu al frotiului de sânge al diapozitivului.
Este practic un reactiv fixativ reducător, deshidratant și coagulant. Prin urmare, funcția sa este de a coagula proteinele și de a le face insolubile, dar fără a le denatura..
Metanolul este cel mai utilizat reactiv de fixare a frotiului în toate laboratoarele, deoarece oferă rezultate mai bune decât etanolul. Concentrația ideală este de 99%.
Tamponul (soluție tamponată) are funcția de a regla sau menține pH-ul colorantului, deoarece un pH ajustat la 7,2 este esențial pentru ca structurile celulare să poată absorbi coloranții în mod corespunzător..
Pe de altă parte, etapa de fixare a metanolului deshidratează celulele și tamponul ajută la rehidratarea acestora..
Eozina are o afinitate pentru blocurile de construcție, deoarece este un colorant acid. Două tipuri de eozină sunt cunoscute foarte asemănătoare, atât de mult încât oricare dintre cele două pot fi utilizate, obținând același rezultat..
Una se numește eozină Y, eozină galbenă sau tetrabromofluoresceină, iar cealaltă se numește eozină B, eritrozină albăstruie B sau dibromodinitrofluoresceină. Cu toate acestea, eozina Y este cea mai frecvent utilizată.
Cea mai importantă proprietate a acestui colorant este polaritatea sa negativă, ceea ce îl face atras de structurile celulare încărcate pozitiv.
Este culoarea de bază. Proprietatea sa principală este metacromia, adică nu toate structurile vor fi colorate de aceeași culoare, depinde de compoziția chimică a structurilor care sunt colorate..
Unele vor deveni deschise sau albastre închise, iar altele vor deveni violet închis sau liliac pal.
1-Efectuați răspândirea probei astfel încât să rămână o peliculă subțire, fie pe o lamă, fie pe o lamă.
2-Lăsați-l să se usuce în aer timp de aproximativ 2 ore.
3-Așezați frotiul uscat pe puntea de colorare sau pe tava de colorare cu răspândirea probei în sus..
4-Acoperiți foaia cu pata Wright picătură cu picătură până când întreaga suprafață este acoperită. Lăsați să acționeze 5 - 8 minute.
5-Pata ar trebui să acopere complet diapozitivul, fără a se vărsa peste margini. Dacă în timpul colorării începe să se evapore, adăugați câteva picături suplimentare.
6-Adăugați ulterior o cantitate egală de amortizor, suflați puțin până când apare strălucirea metalică caracteristică. Cronometrarea 10-15 minute.
7-Spălați cu apă de la robinet, așezând fluxul blând până când foaia arată roz.
8-Cu un tifon impregnat cu alcool, îndepărtați colorantul aderat la spatele lamelei.
9-Lăsați frotiul să se usuce foarte bine înainte de a pune uleiul de imersie pentru a-l vizualiza la microscop.
Este ideal pentru colorarea frotiurilor de sânge periferic, pentru examinarea frotiurilor de sânge groase și pentru studiul celulelor din probe de măduvă osoasă.
Datorită proprietăților chimice ale acestei combinații de coloranți, structurile celulare pot fi ușor recunoscute, putând distinge diferitele tipuri de celule prezente.
Această tehnică este foarte utilă pentru identificarea celulelor secreției nazale (celule epiteliale, eozinofile segmentate, celule polimorfonucleare) în diagnosticul de rinită alergică..
În acest sens, a fost util pentru studiul Leishmania sp în cadrul histiocitelor țesutului celular subcutanat în ulcerele cutanate. De asemenea, este utilizat pentru identificarea leucocitelor în probele de scaun (leucograma fecală).
În acest caz, este de interes pentru medic să știe dacă leucocitoza prezentă în scaun este polimorfonucleară sau mononucleară. Această constatare din leucograma fecală va ghida dacă este vorba de o infecție bacteriană sau, respectiv, virală..
Pe de altă parte, paraziții care circulă în sânge pot fi găsiți în eritrocit sau liberi în plasmă. Paraziții căutați sunt Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii și filariae, iar în medicina veterinară este util în căutarea Theileria equi Da Babesia caballi, agenți cauzali ai bebeziozei, în special la cabaline.
Pata Wright și, de asemenea, pata Giemsa fac posibilă diferențierea hemoparaziților de componentele celulare normale. Pentru aceasta pot fi utilizate două tipuri de spread-uri:
Sângele este răspândit ca o peliculă subțire pe o lamă. Colorat cu pata lui Wright, dezvăluind caracteristicile nucleului și citoplasmei.
Această metodologie este utilizată pentru a investiga prezența paraziților într-o cantitate mai mare de sânge..
Pentru a face acest lucru, o picătură mare de sânge este plasată pe o lamă. Odată ajuns acolo, acesta trebuie defibrilat, făcând cercuri din ce în ce mai mari de la centru spre exterior, folosind marginea unei alte lame..
În cele din urmă, pentru a putea observa paraziții în frotiul gros, eritrocitele trebuie lizate cu apă..
La nivel respirator, această tehnică este de asemenea utilă, deoarece celulele prezente în probele de spută, spălare bronșică sau bronhoalveolară, sunt importante pentru stabilirea diagnosticului..
În mod similar, celulele polimorfonucleare și celulele mononucleare pot fi distinse aici..
Utilizarea acestei tehnici în bacteriologie este limitată, deoarece nu este bună pentru colorarea bacteriilor, motiv pentru care se folosesc alte tehnici specializate de colorare pentru colorarea lor..
Cu toate acestea, a fost folosit pentru a căuta celule epiteliale cu corpuri de incluziune a Chlamydia trachomatis în frotiurile mucoasei uretrale sau endocervicale, deși trebuie recunoscut că nu este cea mai bună metodă pentru acest lucru.
De asemenea, este posibil să se observe bacterii asemănătoare spiralei, cum ar fi Borrelia burgdorferi la pacienții infectați, precum și morule sau corpuri de incluziune a Ehrlichia sp în citoplasma limfocitelor, monocitelor sau neutrofilelor în frotiu de sânge.
Histoplasma capsulatum este o ciupercă patogenă diagnosticată frecvent prin observarea microscopică a diferitelor probe de țesut, colorate cu pata Wright.
Frotiurile probelor de sânge trebuie să se usuce spontan în aer. Frotiurile ar trebui să fie cât mai subțiri posibil pentru a obține o fixare mai bună a colorantului și pentru a evita supracolorarea..
Pentru colorarea de înaltă calitate, se recomandă colorarea în decurs de două ore de la prepararea frotiului. Pe de altă parte, proba ideală este sângele capilar, fără anticoagulant.
Cu toate acestea, dacă se utilizează sânge venos, acesta trebuie utilizat ca anticoagulant EDTA și nu heparină, deoarece acesta din urmă poate deforma structurile celulare.
Pentru a evita deteriorarea colorantului preparat, acesta trebuie depozitat în locuri uscate.
În timpul procesului de spălare, se recomandă utilizarea apei ajustate la un pH neutru..
În cele din urmă, este recomandabil să testați metodele de colorare utilizate în laborator din când în când..
Acest lucru se face prin colorarea eșantioanelor sau a modelelor extinse, ca control al calității. Acest pas este important, deoarece asigură pregătirea corectă a colorării, iar timpul de colorare este bine standardizat..
Dacă foaia de model este slab colorată, atunci există probleme care trebuie rezolvate..
Frotiurile foarte palide se datorează de obicei unui timp de colorare foarte scurt sau spălării excesive. Se corectează prin prelungirea timpului de contact cu vopseaua sau scăderea timpului de spălare.
Prezența precipitațiilor de vopsea în frotiu poate avea mai multe cauze, cu toate acestea, cele mai frecvente cauze sunt: utilizarea vopselei nefiltrate, colorarea pe punți de colorare inegale, utilizarea de foi murdare cu praf sau grăsime, nu spălarea bine finisarea colorării.
Tamponul este responsabil pentru pH-ul colorantului. Coloranții cu un pH sub cel indicat (acid) vor avea ca rezultat frotiuri foarte roșiatice..
Dacă pH-ul vopselei este peste (alcalin) se va obține un frotiu extrem de albăstrui.
Reactivul trebuie păstrat la temperatura camerei.
Nimeni nu a comentat acest articol încă.