endonucleaze sunt enzime care taie legăturile fosfodiester situate în interiorul lanțului nucleotidic. Site-urile de restricție a dondonuclează sunt foarte variate. Unele dintre aceste enzime taie ADN-ul (acidul dezoxiribonucleic, materialul nostru genetic) aproape oriunde, adică sunt nespecifice.
În contrast, există un alt grup de endonucleaze care sunt foarte specifice în regiune sau în secvența pe care urmează să o scindeze. Acest grup de enzime este cunoscut sub numele de enzime de restricție și sunt foarte utile în biologia moleculară. În acest grup avem enzimele bine-cunoscute Bam HI, Eco RI și Alu I.
Spre deosebire de endonucleaze, există un alt tip de proteine catalitice - exonucleaze - care sunt responsabile pentru ruperea legăturilor fosfodiester la capătul lanțului.
Indice articol
Endonucleazele de restricție sau enzimele de restricție sunt proteine catalitice care sunt responsabile de scindarea legăturilor fosfodiester în interiorul lanțului ADN în secvențe foarte specifice.
Aceste enzime pot fi achiziționate de la mai multe companii de biotehnologie și utilizarea lor este aproape esențială în cadrul tehnicilor actuale de manipulare a ADN-ului..
Endonucleazele de restricție sunt denumite folosind primele litere ale numelui științific binomial al organismului din care provin, urmate de tulpină (aceasta este opțională) și se termină cu grupul de enzime de restricție de care aparțin. De exemplu, Bam HI și Eco RI sunt endonucleaze utilizate pe scară largă..
Regiunea ADN pe care enzima o recunoaște se numește situs de restricție și este unică pentru fiecare endonuclează, deși mai multe enzime pot coincide la situsurile de restricție. Acest site constă în general dintr-o scurtă secvență palindromică de aproximativ 4 până la 6 perechi de baze în lungime, cum ar fi AGCT (pentru Alu I) și GAATTC pentru Eco RI..
Secvențele palindromice sunt secvențe care, deși citite în direcția 5 'la 3' sau 3 'la 5', sunt identice. De exemplu, pentru cazul Eco RI, secvența palindromică este: GAATTC și CTTAAG.
Din fericire pentru biologii moleculari, bacteriile au dezvoltat în cursul evoluției o serie de endonucleaze de restricție care fragmentează intern materialul genetic.
În natură, aceste enzime au evoluat - probabil - ca un sistem de protecție bacteriană împotriva invaziei moleculelor de ADN străine, cum ar fi cele din fagi.
Pentru a discrimina între materialul genetic nativ și cel străin, aceste endonucleaze de restricție pot recunoaște secvențe de nucleotide specifice. Astfel, ADN-ul care nu are această secvență poate fi deranjat în interiorul bacteriei..
În schimb, atunci când endonucleaza recunoaște locul de restricție, se leagă de ADN și îl taie..
Biologii sunt interesați să studieze materialul genetic al ființelor vii. Cu toate acestea, ADN-ul este alcătuit din câteva milioane de perechi de baze în lungime. Aceste molecule sunt extrem de lungi și trebuie analizate în fragmente mici..
Pentru a îndeplini acest obiectiv, endonucleazele de restricție sunt integrate în diverse protocoale de biologie moleculară. De exemplu, o genă individuală poate fi capturată și reprodusă pentru analize viitoare. Acest proces se numește „clonarea” unei gene..
Polimorfismele de lungime ale fragmentelor de restricție se referă la modelul secvențelor de nucleotide specifice din ADN pe care endonucleazele de restricție le pot recunoaște și tăia.
Datorită specificității enzimelor, fiecare organism este caracterizat printr-un model specific de tăiere în ADN, originând fragment de lungimi variabile.
Din punct de vedere istoric, endonucleazele de restricție au fost clasificate în trei tipuri de enzime, desemnate cu cifre romane. În ultimul timp, a fost descris un al patrulea tip de endonuclează.
Cea mai importantă caracteristică a endonucleazelor de tip I este că sunt proteine formate din mai multe subunități. Fiecare dintre aceste funcții ca un singur complex proteic și de obicei au două subunități numite R, două M și una S.
Porțiunea S este responsabilă pentru recunoașterea situsului de restricție în ADN. Subunitatea R, la rândul său, este esențială pentru scindare, iar M este responsabil pentru catalizarea reacției de metilare..
Există patru subcategorii de enzime de tip I, cunoscute prin literele A, B, C și D, care sunt utilizate în mod obișnuit. Această clasificare se bazează pe complementarea genetică.
Enzimele de tip I au fost primele endonucleaze de restricție care au fost descoperite și purificate. Cu toate acestea, cele mai utile în biologia moleculară sunt de tip II, care vor fi descrise în secțiunea următoare..
Endonucleazele de restricție de tip II recunosc secvențe ADN specifice și clivează într-o poziție constantă lângă o secvență care produce 5 'fosfați și 3' hidroxili. În general, necesită ioni de magneziu (MgDouă+), dar există unele care au cerințe mult mai specifice.
Structural, pot apărea ca monomeri, dimeri sau chiar tetrameri. Tehnologia recombinantă folosește endonucleaze de tip II și din acest motiv au fost caracterizate peste 3.500 de enzime.
Aceste sisteme enzimatice sunt formate din două gene, numite mod Da vită, acel cod pentru subunitățile care recunosc ADN și pentru modificări sau restricții. Ambele sub-orașe sunt necesare pentru restricție, un proces total dependent de hidroliza ATP..
Pentru a scinda molecula de ADN, enzima trebuie să interacționeze cu două copii ale secvenței de recunoaștere non-palindromică și site-urile trebuie să fie într-o orientare inversă pe substrat. Clivajul este precedat de o translocație a ADN-ului.
În ultimul timp a fost identificat un grup suplimentar. Sistemul este compus din două sau mai multe gene care codifică proteinele care scindează doar secvențe modificate de ADN, fie glucozil metilat, hidroximetilat, fie hidrometilat.
De exemplu, enzima EckKMcrBC recunoaște două dinucleotide de forma generală RmC; o purină urmată de o citozină metilată, care poate fi separată de mai multe perechi de baze - de la 40 la aproape 3000. Scindarea are loc la aproximativ 30 de perechi de baze în spatele locului pe care enzima îl recunoaște.
Endonucleazele de acest tip sunt cunoscute și sub numele de endonucleaze "homing”. Aceste enzime recunosc și taie secvența ADN țintă la situri unice din genom de la 14 la 40 pb.
Aceste enzime sunt adesea codificate în introni și se crede că funcția lor este de a promova transferul orizontal al secvențelor tăiate. După tăiere, are loc o reparație de defecțiune în dubla helică a ADN-ului pe baza secvenței complementare.
Endonuclease I of E coli acționează ca un sistem de apărare împotriva fagilor și paraziților. Se află în principal între membrana citoplasmatică și peretele celular. Produce pauze dublu catenare în ADN-ul străin cu care interacționează în spațiul periplasmic.
Endonucleazele CRISPR-Cas sunt enzime care acționează asupra mecanismului de apărare a multor tipuri de bacterii. Acestea identifică și taie secvențe specifice de ADN de la organismele invadatoare, care sunt în general viruși.
Recent, cercetătorii de la Massachusetts Institute of Technology (MIT) au descoperit sistemul de editare a genomului CRISPR-Cas12bm cu precizie ridicată pentru modificarea celulelor umane.
Nimeni nu a comentat acest articol încă.