proteinază K Este o enzimă care aparține grupului de serin proteaze, adică are o serină aminoacidă în centrul său catalitic activ și are funcția de a rupe legăturile peptidice prin hidroliză. La rândul său, această enzimă aparține familiei proteinelor subtilizinei (peptidaza S8).
Proteinaza K are o greutate moleculară (MW) de 28.900 daltoni și a fost izolată pentru prima dată în 1974 în extracte de ciupercă Album Engyodontium, cunoscut anterior ca Tritirachium album Limber.
Are o capacitate proteolitică ridicată, demonstrată prin faptul că este capabilă să degradeze cheratina prezentă în păr. Cuvântul keratină în engleză este scris „keratină”, de aceea a fost numit „proteinază K”.
Datorită puterii sale ridicate de scindare a proteinelor native, această enzimă este utilă în diverse tehnici de biologie moleculară. Utilizat în principal pentru izolarea și prepararea acizilor nucleici cu greutate moleculară mare (MW).
Proteinaza K funcționează prin eliberarea ADN-ului nuclear, distrugând în același timp proteinele și dezactivează RNaze și DNaze, adică elimină nucleazele din preparatele ADN și ARN..
Pe de altă parte, s-a văzut că proteinaza K poate hidroliza unele proteine native denaturate, ceea ce a stârnit interesul cercetătorilor pentru utilizarea sa în studiul proteinelor prionice (PrPC).
Cu toate acestea, în ciuda potenței lor proteolitice ridicate, există proteine rezistente la acțiunea proteinazei K. Printre acestea se numără unele proteine anormale numite prioni (PrPSc), asociate cu encefalopatii spongiforme transmisibile..
Indice articol
Proteinaza K are o structură terțiară formată din trei straturi, cu o foaie β cu șapte lanțuri interpusă între două straturi de spirale. Deoarece aparține familiei de peptidaze S8, se caracterizează prin faptul că are o triadă catalitică în situl său activ, a cărei ordine secvențială este (Asp, His și Ser), care le diferențiază de alte familii de peptidaze..
Această enzimă din grupul serin proteazei se caracterizează prin hidrolizarea legăturilor peptidice apropiate de grupul carboxilic al aminoacizilor alifatici și aromatici..
Pe de altă parte, este capabil să acționeze în prezența anumitor substanțe corozive, cum ar fi dodecil sulfatul de sodiu (SDS), Tris-HCL și EDTA, care sunt utilizate pentru a ajuta la denaturarea proteinelor, determinându-le să-și piardă structura nativă. ..
Acesta este un pas preliminar în prepararea proteinelor pentru tehnica de electroforeză. Gama de pH la care acționează proteinaza K este destul de largă (2,0 până la 12,0), cu un pH optim între 7,5 și 12,0, iar punctul său izoelectric este de 8,9. După cum se poate observa, este activ împotriva unui interval foarte larg de pH..
O altă caracteristică care se remarcă în proteinaza K este stabilitatea sa în prezența temperaturilor ridicate (50 - 60 ° C)..
Proteinaza K necesită prezența ionului de calciu, deși acest lucru nu afectează activitatea acestuia, dacă este esențial să-și mențină stabilitatea.
Pentru ca proteinaza K să digere complet substratul, este necesar un timp de contact de aproximativ 5 minute până la 2 ore..
Cu toate acestea, în acest sens, Daza și colab. Au comparat puritatea ADN-ului obținut la diferiți timpi de expunere împotriva proteinazei K și au concluzionat că o incubație prelungită (până la 24 ore) îmbunătățește semnificativ calitatea ADN-ului..
Acum, în raport cu concentrația enzimei proteinazei K folosită în diferite protocoale, se poate spune că este foarte variată.
Poate fi utilizat de la concentrații foarte scăzute (5 µg / ml) până la concentrații de 500 µg / ml. Dar cele mai frecvente concentrații de lucru variază între 50-100μg / ml, în special pentru digestia proteinelor și inactivarea nucleazei. Deși pentru tratamentul țesuturilor este necesară o concentrație de 2 mg / ml.
Aplicațiile sale sunt foarte largi și pot fi rezumate după cum urmează:
-Este utilizat în digestia proteinelor și extracția ADN-ului prin diferite metode, cum ar fi: sărarea, PK-SDS, bromură de cetil-trimetil amoniu (CTAB), acetat de potasiu modificat și extracție cu iodură de sodiu..
-Inactivarea nucleozelor (RNaze și DNaze).
-În tehnica de hibridizare in situ (HIS), pentru a ajuta la eliberarea acidului nucleic, pe lângă eliminarea proteinelor nedorite.
-Modificarea proteinelor.
-La nivel de cercetare, în diverse studii.
Au fost efectuate mai multe studii comparative între tehnicile de extracție a ADN-ului care utilizează Proteinase K, cu altele care nu o utilizează și toate concluzionează că există beneficii mai mari atunci când se utilizează enzima. Avantajele includ următoarele:
-Se obține ADN cu greutate moleculară mare, calitate și puritate ridicată.
-ADN-ul extras este stabil până la 3 luni.
ADN-ul extras poate fi utilizat în următoarele tehnici: Southern blot, reacție în lanț a polimerazei (PCR), electroforeză, printre altele..
Diverse investigații au concluzionat că prionii (proteine PrPSc toxice anormale) diferă de proteinele PrPC (native) prin faptul că sunt rezistente la acțiunea proteinazei K, în timp ce PrPC sunt sensibile la acțiunea sa.
Alți autori au descris că în structura PrPSc există porțiuni sensibile și altele rezistente la proteinaza K. Cu toate acestea, ambele părți sunt la fel de toxice și infecțioase..
Pe de altă parte, Bastian și colab. În 1987 au izolat 4 proteine de 28, 30, 66 și 76 kda dintr-o specie de Spiroplasma mirum. Toate s-au dovedit a fi rezistente la acțiunea proteinazei K și au avut, de asemenea, o reacție încrucișată cu unii prioni..
Se știe că această specie poate provoca cataractă și leziuni neurologice semnificative și datorită descoperirilor științifice ale lui Bastian, printre alte investigații, s-a încercat legarea acestui microorganism cu encefalopatiile spongiforme transmisibile..
Cu toate acestea, etiologia acestei patologii neurologice degenerative continuă să fie atribuită prionilor de astăzi..
În acest sens, Butler și colab. În 1991 au identificat și caracterizat o clasă de proteine rezistente la proteinaza K de 40 kda din două tulpini de Mycoplasma hyorhinis. Acest agent patogen afectează porcii, infectându-i țesuturile, dar în acest caz nu a existat nicio reacție încrucișată cu prionii testați..
Sunt necesare mai multe cercetări pentru a elucida multe necunoscute în acest sens.
Nimeni nu a comentat acest articol încă.