testul oxidazei Este o metodă de diagnostic care arată prezența complexului enzimatic numit citocrom oxidază c. Acest sistem induce transformarea citocromului redus la oxidat, deoarece captează oxigenul și acesta la rândul său acționează ca ultimul acceptor de electroni (H+) în lanțul respirator.
Termenul oxidază este un mod scurt de a face referire la enzima citocrom oxidază, cunoscută și sub numele de indofenol oxidază. În antichitate, se credea că enzimele citocrom oxidază și indofenol oxidază erau două enzime diferite, dar astăzi se știe că sunt aceleași.
La rândul lor, citocromii sunt hemoproteine care conțin fier și completează sistemul citocrom oxidazei. Citocromii pot varia de la specie la specie.
Există diferite soiuri de citocromi (citocromi a1, a2, a3 și 0). Unele bacterii pot produce doar una, dar altele până la două sau trei la un moment dat. În acest sens, prezența citocromului a și a3 este cunoscută sub numele de citocrom oxidază c. Acesta este tipul de citocrom detectat de testul oxidazei..
Genurile Neisseria și Pseudomonas conțin citocrom oxidază c. Aceste genuri dau testul oxidazei pozitive, ajutându-le să le diferențieze de genurile Acinetobacter și respectiv Stenotrophomonas..
Există, de asemenea, alte genuri care sunt oxidazice pozitive.
Indice articol
Sistemul citocrom oxidazei c funcționează după cum urmează: microorganismele oxidază pozitive folosesc oxigenul pentru a genera energie prin respirația aerobă. Acest sistem funcționează datorită transportului de electroni de la substanțe donatoare, cum ar fi NADH+ către substanțele receptoare, în acest caz oxigen.
Acest lucru are ca rezultat producerea de energie (ATP) și apă sau apă oxigenată, în funcție de sistemul citocrom oxidazei pe care îl posedă microorganismul..
De aceea, majoritatea bacteriilor pozitive la oxidază sunt, de asemenea, catalază pozitive, o condiție necesară pentru eliminarea peroxidului de hidrogen produs, deoarece această substanță este toxică pentru bacterii..
Sistemul citocrom oxidazei c este prezent în unele bacterii aerobe, în unele anaerobe facultative, în puține microaerofile și fără anaerobi stricți. Acesta din urmă este de înțeles, deoarece anaerobii stricți nu pot trăi în prezența oxigenului, de aceea le lipsește sistemul citocrom oxidazei..
În acest test folosește substanțe care acționează ca acceptori artificiali de electroni, înlocuindu-i pe cei naturali din lanțul de transport al electronilor..
Se utilizează în principal coloranți precum parafenilendiamina și indofenolul, care acționează ca substraturi de receptori și donatori de electroni artificiali.
Parafenilendiamina este oxidată de sistemul citocrom oxidazei c. Colorantul în forma redusă este incolor, dar în forma sa oxidată este colorat.
Așa se evidențiază prezența sistemului citocrom oxidazei c; întrucât o reacție pozitivă va genera o culoare lavandă sau albastru-violet în funcție de reactivul utilizat.
Pe de altă parte, dacă ultima substanță care acceptă electronii din lanțul respirator este diferită de oxigen, testul oxidazei va fi negativ (nu există producție de culoare); acesta este cazul microorganismelor anaerobe.
La fel, dacă citocromul utilizat de microorganism este diferit de citocrom oxidaza c, acesta va da și testul negativ..
Există diverși reactivi și protocoale pentru testul oxidazei, toate pentru același scop..
Reactiv Kovacs, reactiv Gordon și McLeod, reactiv Nadi, Carpenter, reactiv Suhrland și Morrison și utilizarea discurilor de oxidază.
Se compune din 1% clorhidrat de tetrametil-p-fenilendiamină.
Reactivul Kovacs este preparat prin dizolvarea a 1 g din substanța menționată anterior în 50 ml de apă distilată. Se încălzește subtil până se dizolvă complet. Se transferă într-o sticlă de chihlimbar cu capacitate suficientă și se completează volumul la 100 ml cu apă distilată. Așteptați cel puțin 15 minute înainte de utilizare. A se păstra la frigider ferit de lumină.
Este etichetat reactiv Kovacs oxidază, pentru a-l diferenția de reactivul Kovacs utilizat pentru a dezvălui testul indol. Acest reactiv este cel mai sensibil, mai puțin toxic, dar mai scump decât restul reactivilor.
O reacție pozitivă va fi evidențiată cu acest reactiv cu schimbarea culorii coloniei în lavandă, care devine rapid violet aproape negru. O reacție negativă este evidentă deoarece nu există nicio schimbare de culoare în colonie sau ia o ușoară culoare roz. Mediul se poate întuneca și el, dar asta nu înseamnă o reacție pozitivă.
Cu acest reactiv, timpul de reacție este crucial, o schimbare de culoare care are loc între 5 și 15 secunde este considerată o reacție pozitivă..
Este compus din diclorhidrat de dimetil-p-fenilendiamină, cunoscut și sub numele de N-dimetil-p-fenilendiamină sau p-aminodimetilanilină monohidroclorură. Se prepară așa cum este descris pentru reactivul oxidază Kovacs, înlocuind substanța implicată..
Acest reactiv este puțin mai stabil decât reactivul Kovacs oxidază, deși toți reactivii care conțin p-fenilendiamină sunt instabili..
Această reacție este ulterioară, este interpretată ca pozitivă cu apariția unei culori albastru-violet în decurs de 10 până la 30 de minute..
Este compus din 1% α-naftol în alcool etilic (95% etanol) și 1% aminodimetilanilină. Amestecul este preparat în părți egale și folosind alcool etilic absolut ca diluant, până la completarea cantității suficiente pentru 100 ml.
Este compus din 1% oxalat de p-aminodimetilalanină. Se prepară în același mod ca cel descris pentru reactivul Kovacs oxidază, schimbându-se pentru substanța corespunzătoare.
Cu soluția gata, pregătiți benzile de testare după cum urmează: 6-8 cm Benzile de hârtie de filtru Whatman nr. 1 sunt impregnate cu reactiv 1% dimetil-p-fenilendiamină oxalat.
Se lasă să se usuce fără contact cu metalul, se păstrează în borcane cu șurub cu desicant și se păstrează la frigider. Aceste benzi sunt stabile până la 6 luni.
Este cel mai stabil reactiv dintre toți cei menționați și poate dura până la 6 luni în soluție. Un alt punct plus este că nu colorează mediul din jurul coloniei, dacă este utilizat direct pe farfurie.
Apariția unei culori roșii este interpretată ca un test pozitiv.
Sunt discuri comerciale care sunt impregnate cu reactiv pentru testul oxidazei. Există mai multe mărci comerciale pe piață.
Utilizarea sa este destul de practică, deoarece nu este necesar să se pregătească reactivi proaspeți, ceea ce facilitează munca. Rezultatele obținute sunt fiabile atâta timp cât discurile sunt păstrate corespunzător.
Metoda plăcii directe, metoda indirectă pe hârtie și utilizarea discurilor impregnate cu reactivi oxidazici.
2 sau 3 picături din oricare dintre reactivii menționați anterior sunt adăugați în acest scop direct pe colonia (coloniile) conținută într-o placă de mediu de cultură care nu conține glucoză..
Schimbarea sau nu a culorii coloniilor este interpretată, nu a mediului. Timpul de reacție valid depinde de reactivul utilizat.
Tăiați o bucată de hârtie de filtru (Whatman No. 1) la o dimensiune de 6 cmDouă și așezat în interiorul unei cutii Petri goale.
Adăugați 2 sau 3 picături de reactiv Kovacs oxidază pe hârtie, luați o parte din colonie pentru a fi studiată cu un mâner de platină sau cu o scobitoare din lemn și răspândiți-o în linie dreaptă pe hârtia impregnată cu reactiv. Efectuați în decurs de 5-10 secunde.
Cu benzile pregătite cu reactivul Carpenter, Suhrland și Morrison, o bandă uscată se întinde pe o colonie. O singură bandă este utilizată pentru a testa mai multe tulpini. Interpretează în 10 sec.
Umeziți subtil discurile comerciale cu apă distilată sterilă și suprapuneți pe colonia de studiat. Se recomandă utilizarea plăcilor la 35 ° C, dacă se utilizează plăci la temperatura camerei sau plăci frigorifice, reacția este puțin mai lentă. Interpretează schimbarea culorii între 10 și 20 sec.
Pot fi folosite colonii conținute în sânge sau agar de ciocolată.
Umeziți discul așa cum s-a descris anterior. Puneți-l într-o cutie Petri goală. Luați o cantitate suficientă de colonie pentru a studia cu un mâner de platină sau cu o scobitoare din lemn și puneți-o pe disc. Interpretează schimbarea culorii între 10 și 20 sec.
Genul Neisseria și Acinetobacter sunt uneori foarte asemănătoare din punct de vedere morfologic deoarece, deși genul Acinetobacter este o tijă Gram negativă, uneori poate lua o formă coccoidă și poate fi distribuit în perechi, simulând genul Neisseria..
În acest caz, testul oxidazei este foarte util. Genul Neisseria este pozitiv și Acinetobacter negativ.
Cu toate acestea, genul Moraxella este foarte asemănător cu genul Neisseria și ambele dau o reacție pozitivă; de aceea trebuie efectuate întotdeauna teste de fermentare a carbohidraților pentru identificare definitivă.
Pe de altă parte, testul oxidazei este util pentru a diferenția o bacterie aparținând familiei Enterobacteriaceae (toate oxidază negativă) de alți fermentatori, precum genul Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidază pozitivă).
Genul Vibrio și Helicobacter sunt, de asemenea, pozitive la oxidază.
Folosiți tulpini cunoscute de Escherichia coli ca un control negativ și tulpini de Pseudomonas aeruginosa ca un control pozitiv.
-Reactivii trebuie utilizați proaspăt pregătiți, durata lor de valabilitate în soluție la temperatura camerei este scurtă, deoarece sunt foarte instabili. La frigider pot dura între 5 zile și 2 săptămâni.
-Reactivii sunt incolori, dacă își schimbă culoarea, trebuie aruncați. Discurile deteriorate sunt evidente deoarece se întunecă în timp.
-O reacție pozitivă cu reactivul Kovacs oxidază între 15-60 sec este considerată o reacție întârziată și după 60 de secunde ar trebui considerată negativă.
- Haemophylus influenzae dă o reacție oxidază negativă dacă se folosește vreun reactiv cu dimetil-p-fenilendiamină, dar pozitiv dacă se folosește reactivul Kovacs oxidază (tetrametil-p-fenilendiamină).
-Mediile care conțin glucoză interferează cu testul, dând negative negative.
-Tulpini de Bordetella pertussis poate da o reacție fals pozitivă dacă provin din plăci de agar din sânge foarte concentrate.
-Utilizarea mânerelor din metal (fier) dă o reacție fals pozitivă.
-Deoarece reactivii sunt foarte instabili și tind să se autooxideze, se recomandă congelarea alicoturilor de 1 până la 2 ml și îndepărtarea după cum este necesar..
-O altă modalitate de a întârzia auto-oxidarea reactivului este de a adăuga 0,1% acid ascorbic la prepararea reactivilor..
-Deoarece reactivii sunt instabili, se recomandă un control săptămânal al calității..
-Reactivii care nu reușesc testul de control al calității nu trebuie utilizați..
Nimeni nu a comentat acest articol încă.