testul catalazei este o metodologie utilizată în laboratoarele de bacteriologie pentru a releva prezența enzimei catalazice în acele bacterii care o posedă. Împreună cu pata Gram, acestea sunt principalele teste care ar trebui efectuate pe microorganisme nou izolate. Aceste teste îl ghidează pe microbiolog cu privire la pașii de urmat pentru identificarea definitivă a microorganismului în cauză..
În general, bacteriile care conțin citocrom posedă enzima catalază, ceea ce înseamnă că bacteriile facultative aerobe și anaerobe ar trebui să o posede. Cu toate acestea, există excepții, cum ar fi Streptococcus, care, în ciuda faptului că sunt microorganisme anaerobe facultative, nu au enzima catalază.
De aceea, testul catalazei este utilizat în principal pentru a distinge familiile Staphylococaceae și Micrococaceae (ambele catalază pozitive) de familia Streptococaceae (catalază negativă)..
La fel, genul Bacillus (catalază pozitivă) se distinge de genul Clostridium (catalază negativă), printre altele.
Indice articol
Catalaza este o enzimă clasificată ca hidroperoxidază, ceea ce înseamnă că utilizează peroxid de hidrogen (HDouăSAUDouă).
De asemenea, este considerată o oxidoreductază, deoarece în reacția la care participă există un element care servește ca donator de electroni (substanță reducătoare) și un altul ca receptor de electroni (substanță oxidantă).
Catalaza este o proteină care conține un grup proseric cu patru atomi de fier trivalenți (Fe+++), deci este o homoproteină. Ionul feric rămâne oxidat în timpul reacției.
Se poate spune că catalaza este o enzimă detoxifiantă, deoarece funcția sa este de a elimina substanțele produse în timpul metabolismului bacterian care sunt toxice pentru bacterii. Printre aceste substanțe se numără peroxidul de hidrogen.
Peroxidul de hidrogen se formează din descompunerea zaharurilor în aerob. Acest proces are loc după cum urmează:
Ionul superoxid (ODouă-) (radical liber) se formează ca produs final al asimilării glucozei pe cale aerobă. Acesta este toxic și este eliminat de enzima superoxid dismutază care o transformă în oxigen gazos și peroxid de hidrogen.
Peroxidul de hidrogen este, de asemenea, toxic pentru bacterii și trebuie îndepărtat. Enzima catalază descompune peroxidul de hidrogen în apă și oxigen.
Catalaza poate acționa pe alte substraturi decât peroxidul de hidrogen, cum ar fi alcooli, aldehide, acizi, amine aromatice și fenoli. Cu toate acestea, peroxidul de hidrogen poate fi utilizat și de catalază pentru oxidarea altor compuși toxici, cum ar fi alcoolul metilic și etilic..
În mod similar, catalaza este prezentă în celulele fagocitare, protejându-l de acțiunea toxică a peroxidului de hidrogen..
3% peroxid de hidrogen (10 volume).
Diapozitiv pentru microscop
Mâner de plastic de unică folosință sau scobitoare din lemn.
Luați o cantitate suficientă din colonie pentru a studia fără a atinge agarul din care a provenit. Colonia trebuie să fie proaspătă, adică dintr-o cultură de 18 până la 24 de ore.
Așezați colonia pe lamela uscată și adăugați pe ea o picătură de 3% peroxid de hidrogen (puteți utiliza și HDouăSAUDouă 30%). Observați imediat dacă bulele sunt eliberate sau nu.
Reacție pozitivă: evoluția gazului, evidențiată de formarea de bule (bule puternice).
Reacție negativă: nu se formează bule.
Se pune 1 ml de HDouăSAUDouă 3% pe o placă pură sau cultură de pană care nu conține sânge (de preferință agar nutritiv). Observați dacă există sau nu formarea de bule imediat. Puteți utiliza și HDouăSAUDouă 30%.
Este interpretat la fel ca metoda porta object.
Umpleți un tub capilar de 67 mm la o înălțime de 20 mm cu 3% apă oxigenată prin capilaritate.
Atingeți colonia izolată pentru a fi studiată cu capilarul plin de HDouăSAUDouă la 3%. Observați dacă capilarul se umple cu bule în aproximativ 10 secunde. Această metodă permite semicuantificarea reacției în cruci:
Fără cruci, fără bule (reacție negativă).
+ --Puține bule (reacție slabă sau întârziată).
++ -Bule abundente (reacție moderată).
+++ -Bulele ajung la extrema opusă (reacție energetică).
Pe un tobogan curat și uscat așezați o colonie izolată, apoi puneți o picătură de HDouăSAUDouă 0,5% și acoperă cu o lamă de acoperire. Observați dacă există sau nu formarea de bule prinse.
Interpretare: prezența bulelor indică o reacție pozitivă. Fără bule, este interpretat ca o reacție negativă.
Această tehnică trebuie realizată prin controlul pH-ului și temperaturii. Acesta trebuie executat sub o capotă cu flux laminar, deoarece manipularea diferitelor specii de Mycobacterium este periculoasă.
Peroxid de hidrogen 30% sau 110 volume (superoxal).
Tampon fosfat pH 7
10% Tween 80
Cultură de pană Mycobacterium timp de 3 până la 4 săptămâni
Cântărește:
1,361 g (KHDouăPO4) fosfat monopotasic anhidru.
1,420 g fosfat disodic anhidru (Na2HPO3).
Se dizolvă ambele săruri în puțină apă distilată sterilă și se completează până la 1000 ml cu apă.
Faceți o diluție 1:10 la Tween 80 care este concentrat comercial, pentru a face acest lucru, procedați după cum urmează:
Luați 1 ml de Tween 80 și puneți-l în puțină apă distilată, dizolvați și apoi completați volumul cu apă de până la 10 ml.
Se amestecă o cantitate de tampon fosfat cu o cantitate de 10% Tween 80 (în părți egale). Definiți în laborator cât de mult doriți să pregătiți.
Așezați 5 ml de tampon fosfat într-o eprubetă sterilă cu capac cu șurub (bakelită).
Cu o buclă de inoculare, luați suficientă colonie dintr-o creștere de Mycobacterium însămânțată în pene și dizolvați-o în tamponul fosfat.
Capaceți tubul fără a strânge prea mult firul. Se pune într-o baie de apă la 68 ° C timp de 20 până la 30 de minute. Se îndepărtează și se răcește la 22-25 ° C
Măsurați 0,5 ml de reactiv final (amestecați) și adăugați-l în tub cu soluția rece. Observați formarea sau nu a bulelor.
Este interpretat la fel ca tehnicile anterioare.
Când se obține creșterea coloniilor în medii îmbogățite, trebuie efectuată o colorație Gram și un test catalazic pe coloniile obținute. Acest lucru îl va ghida pe microbiolog cu privire la procedurile de urmat pentru identificarea definitivă..
Pentru a evalua performanța bună a reactivului peroxid de hidrogen, utilizați tulpini de control proaspăt cultivate, cum ar fi Staphylococcus aureus ca un control pozitiv și tulpini de Streptococ sp ca control negativ.
O altă alternativă care servește ca un control pozitiv este de a plasa o picătură de peroxid de hidrogen pe agar din sânge, eritrocitele au catalază, prin urmare, va exista o clocotire dacă reactivul este în stare bună.
Un agar de ciocolată poate fi folosit ca un control negativ, aici eritrocitele sunt deja lizate și testul este negativ.
-Nu folosiți culturi vechi pentru test, deoarece acest lucru poate duce la negative negative.
-Evitați să luați colonii din culturi de agar din sânge, dacă aveți grijă să nu atingeți agarul; această procedură poate duce la fals pozitivi, deoarece eritrocitele conțin catalază.
-Dacă luați apă de colonie cu buclă de platină, nu inversați ordinea procedurii, deoarece acest lucru poate duce la fals pozitive. Acest lucru se datorează faptului că platina este capabilă să reacționeze cu peroxid de hidrogen, provocând o barbotare..
-Nu utilizați reactivul de peroxid de hidrogen dacă este foarte vechi, deoarece reactivul este foarte instabil și tinde să se descompună în timp..
-Păstrați reactivul peroxid de hidrogen protejat de lumină și refrigerat pentru a evita deteriorarea..
-Efectuați o verificare a calității reactivului peroxid de hidrogen de fiecare dată când este utilizat.
-Luați în considerare faptul că dacă HDouăSAUDouă la 30% reacțiile sunt mai puternice decât cele efectuate cu HDouăSAUDouă la 3%.
Nimeni nu a comentat acest articol încă.