Secvențierea ADN-ului (acidul dezoxiribonucleic) este o procedură efectuată în laboratoarele de biologie moleculară care permite cunoașterea ordinii nucleotidelor din materialul genetic de interes. În plus, secvențierea ARN (acid ribonucleic) poate fi, de asemenea, dezvăluită.
Această tehnică a fost indispensabilă pentru dezvoltarea științelor biologice. Se aplică și altor domenii ale cunoașterii - cum ar fi diagnosticul medical și investigațiile criminalistice, de exemplu.
Anterior, secvențierea unei catene de ADN a fost considerată o activitate lentă și costisitoare, care a permis identificarea doar a câtorva perechi de baze în oligonucleotide.
Astăzi, cu toate progresele științifice, secvențierea ADN-ului este o operație de rutină în multe laboratoare din întreaga lume datorită contribuției a aproape 50 de ani de cercetare în acest domeniu. În ceea ce privește lungimea lanțului, până la milioane de perechi de baze pot fi secvențiate într-un timp foarte scurt.
Pentru a face acest lucru, există zeci de tehnici dezvoltate care variază în ceea ce privește prețul și precizia. În acest articol, vom descrie atât tehnicile clasice, cât și cele moderne, fiecare cu avantajele și dezavantajele sale..
Până în prezent, tehnicile de secvențiere permit obținerea secvenței genomurilor complete, de la procariote mici și drojdii până la genomul uman..
Indice articol
Pentru a înțelege metodele și tehnicile utilizate pentru secvențierea ADN-ului, este necesar să se cunoască anumite aspecte cheie ale structurii și compoziției moleculei..
ADN-ul este o biomoleculă care se găsește în toate viețuitoarele, de la bacterii la animale acvatice mari. Organitele - cum ar fi mitocondriile și cloroplastele - au în interior o moleculă circulară de ADN. Chiar și în unele virusuri, materialul genetic găsit este ADN-ul.
Structural, ADN-ul este o colecție de nucleotide. Fiecare este alcătuit dintr-un carbohidrat, o bază azotată (A, T, C sau G) și o grupare fosfat. Scopul secvențierii ADN este de a dezvălui ordinea în care cele patru baze azotate se găsesc în secvență..
La mijlocul anilor 1950, cercetătorii Watson și Crick au descris structura ADN-ului folosind tehnici cristolografice. Cu toate acestea, niciunul dintre acești cercetători nu a reușit să găsească o modalitate de a desface secvența..
Deși au existat anumiți predecesori, cel mai important eveniment a fost crearea metodei Sanger, în 1977. Frederick Sanger, tatăl metodei, a fost un biochimist britanic, câștigător a două premii Nobel pentru contribuțiile sale enorme la științele biologice..
Această tehnică este, de asemenea, cunoscută în literatură sub denumirea de „terminație de lanț” sau dideoxinucleotide. Principiile acestei tehnici și cele care au fost dezvoltate pe baza îmbunătățirii și inovației acestei tehnici vor fi descrise mai jos..
Dezvoltarea metodei Sanger a reprezentat un eveniment crucial în biologia moleculară. Acesta implică componentele de bază ale procesului de replicare a ADN-ului care are loc în mod normal în celulă, dar adăugând o componentă specială: dideoxinucleotide.
- ADN polimerază: enzima ADN polimerază este un element crucial al procesului. Această moleculă participă la replicarea catenei ADN și rolul acesteia este sinteza noii catene, împerecherea trifosfat dezoxiribonucleotidelor cu cele complementare..
Reamintim că în ADN timinele (T) se împerechează cu adeninele (A) prin două legături de hidrogen, în timp ce citozina (C) o face cu guanina (G) prin trei punți..
- Nucleotide: Secvențierea Sanger implică două tipuri de nucleotide, cele patru 2'-deoxinucleotide (prescurtate ca dATP, dGTP, dCTP și dTTP) și cele patru dideoxinucleotide speciale (ddATP, ddGTP, ddCTP și ddTTP)..
Deși dideoxinucleotidele sunt similare cu monomerii care sunt încorporați în mod normal în ADN, le lipsește o grupare -OH în structura lor. Acest lucru face imposibilă adăugarea unui nou nucleotid în lanț..
Prin urmare, atunci când o nucleotidă specială este adăugată - într-un mod total aleatoriu - la lanțul în formare, sinteza este paralizată. În acest fel, la sfârșitul reacției, există lanțuri de dimensiuni diferite, fiecare în care reacția a fost oprită într-un punct diferit..
Experimental, sunt pregătite patru teste. Fiecare conține ADN-ul extras din proba biologică de interes, nucleotidele normale și unul dintre cele patru tipuri speciale de nucleotide. Sau nucleotidele speciale sunt marcate cu un anumit tip de marker fluorescent (a se vedea secvențierea automată mai jos).
Primul pas este de a separa fiecare dintre lanțurile sintetizate în funcție de mărimea lor. Unele vor fi mai lungi decât altele, în funcție de locul în care au fost încorporate bazele speciale..
Există diferite tehnici biochimice care permit separarea componentelor unui amestec folosind dimensiunea ca proprietate discriminatorie. În metoda lui Sanger, diferitele lanțuri sunt separate prin electroforeză. În variantele mai sofisticate ale tehnicii, se folosește electroforeza capilară.
Astfel, firele mai lungi călătoresc mai puțin decât variantele mai scurte. Acest sistem trece apoi printr-un cititor care recunoaște markerul inclus în fiecare dideoxinucleotidă. În acest fel, se poate cunoaște ordinea secvenței.
Această tehnică de „prima generație” este capabilă să citească fragmente de ADN de cel mult 1 kilobază. În prezent, metoda Sanger este utilizată în diverse laboratoare, în general în variantele sale moderne. În plus, este folosit pentru a corobora rezultatele obținute cu cele mai complexe tehnici - dar mai puțin precise..
Când secvențierea este necesară pe scară largă, procesul este accelerat prin automatizare. Aceasta este o variantă a metodei de terminare a lanțului Sanger, în care primerii sunt etichetați cu produse fluorescente pentru a le distinge..
Ulterior, produsul de reacție este rulat într-o electroforeză - totul într-o singură bandă. Când fiecare fragment iese din porțiunea finală a gelului, acesta este identificat rapid prin etichetarea sa fluorescentă, cu o eroare în jurul valorii de 1%..
Cele mai sofisticate sisteme au un sistem de până la 96 de tuburi capilare gestionate de un computer cuplat la un robot. Adică, 96 de probe de ADN pot fi testate simultan. Astfel, procesul care implică electroforeza și analiza rezultatelor este complet automatizat..
Într-o zi, aceste sisteme pot secvența până la 550.000 de baze. În timpul procesului, munca umană nu este necesară, durează doar 15 minute pentru a porni metoda.
În același timp în care Sanger și-a publicat lucrarea, doi cercetători pe nume Allan Maxan și Walter Gilbert au reușit să dezvolte o altă metodă pentru a obține secvența ADN. Metoda a câștigat popularitate la acea vreme, dar a fost ulterior înlocuită de îmbunătățirea metodei lui Sanger..
Contrar metodei Sanger, secvențierea Maxan și Gilbert (sau secvențierea chimică, așa cum se știe și) nu implică reacții de hibridizare. Metodologia constă în etichetarea cu agenți reactivi la un capăt, urmată de un proces de purificare..
Unul dintre aspectele negative ale acestei tehnici constă în complexitatea ei enormă și în utilizarea substanțelor chimice periculoase pentru utilizator. Defalcările chimice sunt induse de aplicarea DMS, acid formic, hidrazină și hidrazină cu săruri.
Protocolul începe cu marcarea la capătul 5 'al catenei cu markerul fosforos 32, apoi are loc o modificare chimică a bazei azotate și este separată. În cele din urmă, apare scindarea regiunii abasice.
Mai întâi lanțul care trebuie secvențiat este scurtat în segmente mai mici. Această etapă se realizează cu enzime de restricție, care duc la capete proeminente..
Apoi, reacția se efectuează cu o fosfatază alcalină, al cărei scop este eliminarea grupării fosfat. Astfel, o polinucleotid kinază poate fi utilizată pentru a efectua marcarea..
Lanțul este denaturat (cele două fire se deschid). Apoi se aplică substanțele chimice. Aceste reacții de clivaj se fac într-un mod controlat și se știe ce tipuri de legături rupe fiecare substanță chimică aplicată..
Ca și în metoda Sanger, citirea rezultatelor implică separarea în funcție de dimensiune a lanțurilor obținute într-un sistem de electroforeză. Sistemele compuse din poliacrilamidă permit obținerea unei rezoluții foarte adecvate pentru citirea gelului.
Secvențierea în masă cuprinde o serie de metode noi, prescurtate ca NGS, din engleză "Secvențierea următoarei generații ".
Metodele clasificate ca NGS necesită o etapă anterioară de amplificare a ADN-ului (nu funcționează cu o singură moleculă). În plus, platformele utilizate variază foarte mult. Principiile celor mai populare metode vor fi descrise mai jos:
Aceasta implică monitorizarea eliberării unui pirofosfat, care are loc de fiecare dată când se adaugă o nouă nucleotidă la catena ADN. Un sistem enzimatic este cuplat, astfel încât emisia de lumină (care este detectabilă de o cameră) are loc de fiecare dată când este încorporată o nouă nucleotidă.
Procesul începe cu incubarea separată a fiecărei baze azotate pentru a verifica dacă există sau nu emisie de lumină. Pirosecvențierea poate citi fire lungi, dar rata de eroare găsită este mare.
Aceasta implică încorporarea nucleotidelor marcate. Aceste componente fluorescente sunt adăugate, spălate și se notează nucleotida încorporată. Apoi, eticheta nucleotidică este îndepărtată și sinteza catenelor poate continua. În etapa următoare, o nucleotidă marcată va fi de asemenea încorporată și etapele menționate mai sus vor fi repetate..
Un dezavantaj al acestei tehnici apare atunci când markerii fluorescenți nu sunt complet eliminați. Aceste emisii creează erori de fond, rezultând erori semnificative.
Această tehnică diferă de celelalte, deoarece nu folosește ADN polimerază. În schimb, enzima cheie pentru această metodologie este ligaza. Aici se utilizează fragmente de ADN marcate fluorescent, este ligat de enzimă și este detectat.
Cea mai mare problemă cu această tehnică este lungimea scurtă a fragmentului pe care este capabilă să o proceseze..
Această tehnică se bazează pe măsurarea ionului H+ care este eliberat de fiecare dată când este încorporată o nouă nucleotidă. Principiul este destul de similar cu piroza secvențierea, dar mult mai ieftin.
Secvențierea genomului uman a fost una dintre cele mai promițătoare provocări din biologie, precum și una dintre cele mai apreciate rivalități din istoria științei. De fapt, pentru oamenii de știință implicați în proiect, secvențierea genomului a devenit o competiție..
În 1990 a început ceea ce s-a numit „proiectul genomului uman”, condus de celebrul om de știință, laureat al Premiului Nobel, James Watson. După un an, în 1991, Venter își asumă provocarea de a „bate” pe Watson și de a secvenția genomului în fața lui. Cu toate acestea, în 1992, Watson s-a retras și comanda a fost luată de un alt cercetător.
În 1995, Venter și-a anunțat succesul în secvențierea completă a unui genom bacterian prin metoda de secvențiere aleatorie. În mod similar, echipa adversă a anunțat un an mai târziu secvențierea genomului drojdiei..
În anul 2000 cursa a fost încheiată. Ambele companii și-au publicat rezultatele preliminare ale întregului genom în două dintre cele mai prestigioase reviste științifice: Natură Da Ştiinţă.
Cu toate acestea, oamenii de știință au continuat să lucreze la îmbunătățirea propunerilor, iar în 2006 secvențele anumitor cromozomi umani au fost finalizate..
Cunoașterea ordinii nucleotidelor unei molecule la fel de importante ca ADN-ul este valoroasă pentru biologi și profesioniști înrudiți. Acest lanț de polinucleotide conține toate informațiile necesare dezvoltării și întreținerii tuturor formelor de viață..
Din aceste motive, cunoașterea acestei secvențe este esențială pentru cercetarea biologică. În principiu, secvențierea face posibilă măsurarea uneia dintre cele mai importante proprietăți ale sistemelor biologice și stabilirea diferențelor între ele..
Secvențierea este utilizată pe scară largă de taxonomiști și sistematici, deoarece anumite secvențe de ADN permit stabilirea criteriilor pentru a concluziona dacă două organisme aparțin sau nu aceleiași specii, pe lângă faptul că pot propune ipoteze despre relațiile filogenetice dintre ele..
În plus, secvențierea ADN-ului are aplicații în medicină și diagnostic. De exemplu, există sisteme ieftine și accesibile care, prin secvențiere, fac posibilă evaluarea tendinței de a dezvolta anumite boli (cum ar fi cancerul) folosind așa-numitele polimorfisme cu nucleotide unice (SNP)..
Investigațiile criminalistice și criminalistice au fost, de asemenea, îmbogățite cu tehnici de secvențiere, care pot fi utilizate ca dovezi fiabile ale participării unei anumite persoane la o infracțiune.
Nimeni nu a comentat acest articol încă.