DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) Este un colorant care, datorită proprietății sale fluorescente, servește ca marker, fiind utilizat pe scară largă în microscopia de fluorescență sau tehnica de citometrie în flux, printre altele. Fluorescența pe care o emite este de un albastru strălucitor, excitația sa are loc între 455-461 nm (lumină UV).
Vopseaua DAPI poate trece cu ușurință prin membrana celulară a celulelor moarte. De asemenea, poate colora nucleele celulelor vii, dar în acest caz, concentrația acestora trebuie să fie mai mare.
Vopseaua este capabilă să acceseze ADN-ul celular pentru care are o afinitate specială, legându-se cu o mare aviditate de bazele azotate adenină și timină. Din acest motiv, este foarte util în unele tehnici de biologie moleculară..
Acest compus aparține grupului de coloranți indoli și s-a demonstrat că are o sensibilitate mai mare la ADN decât bromura de etidiu și iodura de propidiu, în special pe gelurile de agaroză..
Utilizarea acestui colorant fluorescent este foarte largă, deoarece este utilă pentru: studierea modificărilor ADN-ului în procesele apoptotice (moartea celulară) și, prin urmare, detectarea celulelor în acest proces; pentru amprenta foto ADN (imprimare foto ADN); să studieze contaminarea bacteriană; sau pentru a vizualiza segmentarea nucleară.
De asemenea, a fost utilizat în studiul benzilor cromozomiale, în detectarea ADN-ului din Micoplasme sp, în interacțiunea ADN-proteină, în colorarea și numărarea celulelor prin imunofluorescență și chiar pentru colorarea boabelor de polen mature.
Indice articol
DAPI este prescurtarea denumirii sale chimice (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Formula sa moleculară este C16HcincisprezeceN5. Are o greutate moleculară de 350,3. În apropierea intervalului de lumină UV (345 până la 358 nm) apare excitația maximă a complexului DAPI-ADN, în timp ce emisia maximă de fluorescență are loc între 455-461 nm..
Acest colorant se caracterizează prin faptul că este o pulbere galbenă, dar structurile marcate cu acest fluorofor emit o lumină albastră strălucitoare..
Este un compus solubil în apă, cu toate acestea, pentru a accelera dizolvarea acestuia, se poate aplica o anumită căldură. Poate fi diluat cu PBS dar nu dizolvat direct în el..
Odată preparat colorantul, acesta trebuie păstrat în întuneric, adică protejat de lumină, la o temperatură de 2 până la 8 ° C (frigider). În aceste condiții, vopseaua este stabilă mai mult de 3 săptămâni sau luni..
Dacă este protejat de lumină, dar lăsat la temperatura camerei, stabilitatea acestuia scade la 2 sau 3 săptămâni, dar expusă la lumina directă deteriorarea este foarte rapidă. Dacă doriți să păstrați mai mult timp, acesta poate fi refrigerat la -20 ° C distribuit în alicote.
Această colorare se bazează pe generarea unei contracoluri nucleare în principalele tehnici de biologie moleculară, cum ar fi: citometria în flux, microscopia fluorescentă și colorarea cromozomilor metafazici sau a nucleilor interfazici, printre altele..
Această tehnică se bazează pe marea afinitate pe care o are vopseaua pentru bazele azotate (adenină și timină) conținute în materialul genetic (ADN) din canelura minoră. În timp ce la nivel citoplasmatic lasă foarte puțin fundal.
Când vopseaua fluorescentă se leagă de regiunile adenină și timină ale ADN-ului, fluorescența crește semnificativ (de 20 de ori mai mult). Culoarea pe care o emite este albastru strălucitor. În special, nu există nicio emisie de fluorescență atunci când se leagă de perechile de baze GC (guanină-citozină).
Este important de reținut că, deși are și o afinitate pentru ARN, acest lucru nu cauzează o problemă, deoarece cel mai înalt grad de emisie de energie de la această moleculă are loc la o altă lungime de undă (500 nm), spre deosebire de ADN, care face acest lucru la 460 nm . În plus, creșterea fluorescenței odată atașată la ARN este de doar 20%..
DAPI este utilizat mai mult pentru a colora celulele moarte (fixe) decât celulele vii, deoarece este necesară o concentrație mult mai mare de colorant pentru colorarea acestuia din urmă, deoarece membrana celulară este mult mai puțin permeabilă la DAPI când este vie.
Pata DAPI poate fi utilizată în combinație cu fluorofori roșii și verzi pentru o experiență multicoloră.
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) este un fluorofor excelent și, prin urmare, este utilizat pe scară largă în diverse tehnici și în diverse scopuri. Utilizarea DAPI în principalele tehnici este explicată mai jos.
Cercetătorii Gohde, Schumann și Zante în 1978 au fost primii care au folosit și au propus DAPI ca fluorofor în tehnica citometriei în flux, având un mare succes datorită sensibilității sale ridicate la ADN și a intensității sale ridicate în emisia de fluorescență..
Utilizarea DAPI în această tehnică permite studierea ciclului celular, cuantificarea celulelor și colorarea celulelor vii și moarte..
Deși există și alți coloranți, cum ar fi bromura de etidiu, oxidul Hoechst, portocala acridină și iodura de propidiu, DAPI este unul dintre cele mai utilizate, deoarece este mai fotostabil decât cele menționate anterior..
Pentru această tehnică este necesară fixarea celulelor, pentru aceasta se poate folosi etanol absolut sau paraformaldehidă 4%. Proba este centrifugată și supernatantul este aruncat, ulterior celulele sunt hidratate prin adăugarea a 5 ml de tampon PBS timp de 15 minute..
În timp ce trece timpul, pregătiți pata DAPI cu un tampon de colorare (FOXP3 din BioLegend) la o concentrație de 3 µM.
Centrifugați proba, aruncați supernatantul și apoi acoperiți cu 1 ml soluție DAPI timp de 15 minute la temperatura camerei..
Duceți proba la citometrul de flux cu laserul corespunzător.
O altă tehnică în care se utilizează DAPI este în microfluorometria de flux împreună cu un alt fluorofor numit mitramicină. Ambele sunt utile pentru cuantificarea ADN-ului cloroplastului în mod individual, dar DAPI este cel mai potrivit pentru măsurarea particulelor de bacteriofag T4..
Această tehnică utilizează practic sonde ADN marcate cu un colorant fluorescent care poate fi DAPI..
Eșantionul necesită tratament termic pentru denaturarea ADN-ului cu două fire și transformarea acestuia în două fire cu un singur fir. Ulterior, este hibridizat cu o sondă ADN denaturată marcată cu DAPI care are o secvență de interes..
Mai târziu se spală pentru a elimina ceea ce nu s-a hibridizat, se folosește un contrast pentru a vizualiza ADN-ul. Microscopul cu fluorescență permite observarea sondei hibridizate.
Această tehnică are scopul de a detecta secvențe specifice în ADN-ul cromozomial, putând pune diagnosticul anumitor boli.
Aceste tehnici cito-moleculare au fost de mare ajutor în determinarea detaliilor în studiul cariotipurilor. De exemplu, a arătat regiunile bogate în perechi de baze adenozină și timină numite regiuni heterocromatice sau benzi DAPI..
Această tehnică este utilizată pe scară largă pentru studiul cromozomilor și cromatinei la plante și animale, precum și în diagnosticul patologiilor prenatale și hematologice la om..
În această tehnică, concentrația recomandată de DAPI este de 150 ng / ml pentru un timp de 15 minute..
Lamelele asamblate trebuie păstrate protejate de lumină la 2-8 ° C.
Celulele sunt fixate cu 4% paraformaldehidă. Dacă urmează să se utilizeze alte pete, DAPI este lăsat la sfârșit ca contra-pata și celulele sunt acoperite cu soluție de PBS timp de 15 minute. În timp ce trece timpul, pregătiți soluția DAPI prin diluarea cu PBS, astfel încât concentrația finală să fie de 300 µM.
Apoi excesul de PBS este îndepărtat și acoperit cu DAPI timp de 5 minute. Se spală de mai multe ori. Diapozitivul este observat într-un microscop cu fluorescență sub filtrul corespunzător.
Acest compus trebuie manipulat cu grijă, deoarece este un compus care are proprietăți mutagene. Cărbunele activ este utilizat pentru a elimina acest compus din soluțiile apoase care vor fi aruncate..
Mănuși, halat și ochelari de protecție trebuie folosiți pentru a evita accidentele cu acest reactiv. Dacă apare contactul cu pielea sau mucoasa, zona trebuie spălată cu suficientă apă.
Nu trebuie să pipetați niciodată acest reactiv pe cale orală, utilizați pipete.
Nu contaminați reactivul cu agenți microbieni, deoarece acest lucru va duce la rezultate eronate.
Nu diluați colorarea DAPI mai mult decât recomandat, deoarece aceasta va scădea semnificativ calitatea colorării..
Nu expuneți reactivul la lumina directă și nu vă mențineți cald, deoarece aceasta reduce fluorescența.
Nimeni nu a comentat acest articol încă.