frotiu bacterian este o extensie de film subțire a unei suspensii de microorganisme bacteriene care se realizează pe o placă de sticlă transparentă sau diapozitiv, pentru observare la microscopul optic.
Extinderea sub formă de film se realizează pentru a separa microorganismele cât mai mult posibil, deoarece dacă acestea sunt grupate, observația nu este clară.
În studiul culturilor bacteriene, se folosesc tehnici de preparare, fixare și colorare a frotiului pentru a le analiza mai bine. Datorită dimensiunii reduse a microorganismelor, utilizarea unui microscop optic este necesară pentru observarea lor..
Microscoapele optice sunt instrumente indispensabile pentru observarea frotiurilor. Acestea folosesc lentile optice și lumină care permit vizionarea probelor cu mărire mare..
În general, celulele vii nu au în mare parte structuri colorate, văzute cu microscopul cu lumină sunt probe incolore, transparente și prezintă un contrast intern foarte mic și cu mediul lor..
Observarea cu microscopul optic simplu cu câmp luminos, fără utilizarea tehnicilor auxiliare de colorare, este foarte limitată și este utilizată doar în unele cazuri, cum ar fi observarea mișcării microorganismelor.
Pentru observarea optimă a microorganismelor, trebuie găsit un echilibru între contrast și rezoluție. Detaliile celulei nu pot fi văzute la microscop, chiar și cu rezoluție mare; utilizarea coloranților este necesară prin tehnici de colorare, care oferă contrast pentru observare.
Indice articol
Pentru a obține un contrast excelent sunt numiți microscoape sofisticate microscop cu contrast de fază, microscop cu interferență diferențială și microscop cu câmp întunecat. Acest tip de microscop este utilizat pentru a observa, printre altele, structuri bacteriene, cum ar fi învelișuri și filamente..
Colorarea este o tehnică simplă de creștere a contrastului care se realizează cu un microscop cu câmp luminos. În această tehnică, pot fi folosiți diferiți coloranți care îmbunătățesc semnificativ observarea microscopică..
Petele se efectuează direct pe frotiurile sau prelungirile suspensiilor de microorganisme de pe lamele, uscate și fixate anterior..
Fixarea este o tehnică utilizată pentru conservarea structurilor celulare; provoacă inactivarea microorganismelor și aderența la sticla lamelei. Există diferite tratamente de fixare: fixare termică și fixare chimică.
Aceasta este cea mai utilizată metodă de observare a frotiurilor bacteriene. Tehnica constă în trecerea suspensiei bacteriene a frotiului prin flacăra brichetei. Această tehnică este capabilă să păstreze morfologia externă a bacteriilor, dar distruge structurile lor interne..
Fixarea chimică folosește substanțe chimice de conservare, cum ar fi formaldehida sau formaldehida, etanolul și acidul acetic, printre altele. Avantajul utilizării agenților chimici de fixare este că se realizează conservarea structurilor celulare interne ale microorganismelor..
Cele mai frecvente proceduri pentru colorarea unui frotiu anterior uscat și fixat sunt colorarea pozitivă sau simplă, colorarea diferențială și colorarea negativă. Există, de asemenea, tehnici speciale pentru colorarea anumitor structuri celulare (capsulă, spori, flageli).
Colorarea pozitivă sau simplă este cea mai utilizată tehnică de colorare a frotiului. Folosește coloranți care au capacitatea de a se lega de anumite structuri microbiene, permițându-le să fie observate la microscop.
Acești coloranți au grupări cromofore (porțiune colorată) în structura lor chimică, cu legături duble și legături simple alternante (conjugare). Aceste legături pot stabili la rândul lor legături ionice sau covalente cu unele structuri celulare..
Petele utilizate în colorarea pozitivă sau simplă sunt în mare parte derivați chimici ai anilină (săruri organice colorate).
Pe de altă parte, printre coloranți putem găsi unii cu un pH bazic și alții cu un pH acid..
În coloranții de bază, grupul cromofor are o sarcină electrică pozitivă. Marea majoritate a microorganismelor procariote au un pH intern neutru, iar suprafața lor celulară este încărcată negativ. Prin această interacțiune electrostatică, cromoforul se leagă de celulă și o colorează.
Exemple de coloranți de bază sunt albastru de metilen, violet de cristal, verde de malachit, fuscină de bază, safranină, printre altele..
În coloranții acizi, grupul cromofor are o sarcină electrică negativă. Acestea sunt utilizate pentru a colora proteinele cu grupări amino încărcate pozitiv. Exemple de coloranți acizi sunt fuscina acidă, trandafirul bengal, roșu Congo și eozină.
Tehnica colorării diferențiale constă în aplicarea a doi coloranți de culoare sau intensitate diferită, pentru a distinge diferitele microorganisme la microscop. Pata de Gram și pata de rezistență la acid-alcool sunt cele mai utilizate pete diferențiale în bacteriologie.
Colorarea Gram este utilizată ca test preliminar pentru a cunoaște forma, dimensiunea, gruparea celulară, precum și tipul de perete celular. Folosind testul pentru pata Gram, bacteriile peretelui celular sunt clasificate în bacterii Gram pozitive și bacterii Gram negative..
În această tehnică, se folosesc coloranți chimici care nu pătrund în interiorul celulei, dar fac ca mediul în care sunt microorganismele să apară ca fundal negru..
În tehnica de colorare negativă, frotiul se face cu o picătură de cerneală India sau suspensie de nigrozină, care după ce a permis uscarea la temperatura camerei formează o peliculă opacă la trecerea luminii. În acest fel, microorganismele sunt văzute ca forme luminoase pe un fundal întunecat..
1.- Spălați lamele foarte bine, uscați-le cu hârtie absorbantă și etichetați-le. Eticheta trebuie să indice conținutul preparatului, data și numele persoanei care a prelucrat-o..
2.- Aprindeți bricheta și sterilizați bucla de inoculare în flacără până la roșu aprins.
3.- Lăsați mânerul să se răcească.
4.- Luați tubul de cultură bacteriană, scoateți capacul și treceți rapid gura tubului lângă flacăra arzătorului (flacără).
5.- Introduceți bucla de inoculare în tubul care conține cultura bacteriană și luați proba.
6.- Dacă cultura este în mediu lichid, așezați proba luată cu mânerul în centrul lamelei și întindeți-o cu grijă într-un cerc de aproximativ 2 cm în diametru..
7.- Sterilizați din nou bucla de inoculare.
8.- Lăsați frotiul să se usuce în aer.
9.- Repetați pașii de la 3 la 8 de trei ori.
10.- Dacă cultura se află în mediu solid, o picătură de apă distilată trebuie plasată anterior pe lamă. Acest lucru se face pentru a amesteca o mică probă din cultura luată cu bucla de inoculare, așa cum este indicat în pașii 2-5 (condiții aseptice).
11.- Răspândiți proba diluată cu picătura de apă pe lamelă și repetați de trei ori.
1.- Adăugați două picături de metanol sau etanol absolut la frotiurile uscate din culturi în mediu lichid..
2.- Lăsați aerul să se usuce departe de brichetă.
3.- Dacă frotiul provine dintr-o cultură pe mediu solid, frotiul uscat este fixat cu căldură, trecându-l de 2 până la 3 ori rapid prin partea cea mai fierbinte a flăcării mai ușoare..
4.- Atingeți partea inferioară a frotiului cu partea dorsală a mâinii stângi (pentru dreapta; în caz contrar, folosiți mâna dreaptă) și verificați dacă este frig.
1.- Adăugați 2 picături din pata selectată pe frotiu și lăsați să acționeze pentru timpul necesar în protocoalele specifice pentru fiecare pete (în general între 1 și 5 minute).
2.- Unele pete necesită utilizarea căldurii pentru activarea lor, caz în care trebuie să fiți foarte atenți atunci când încălziți diapozitivul în flacăra mai ușoară (manipulați-l cu o pensetă și evitați fierberea). O supraîncălzire a frotiului poate distruge celulele care trebuie observate..
3.- Îndepărtați excesul de colorant spălând cu apă distilată dintr-o picetă. Îndepărtați apa de spălare atingând ușor diapozitivul pe marginea acestuia, înclinat pe masa de lucru.
4.- Permiteți uscarea în aer.
5.- În funcție de tipul de observație, în această etapă se folosește sau nu o copertină. Lamela de acoperire protejează și păstrează frotiul. Dacă se face o observație prin imersie în ulei în această etapă, nu se utilizează lamele de acoperire, dar frotiul nu poate fi conservat.
1.- Scufundați frotiul succesiv în fiecare dintre soluțiile indicate mai jos, timp de minimum 5 minute. Scopul acestor „băi” este de a lăsa frotiul complet deshidratat. Fiecare reactiv trebuie să fie bine drenat înainte de a introduce frotiul în următoarea baie..
Ordinea băilor de deshidratare este următoarea:
Apoi lăsați să se usuce la aer.
2.- Montați capacul, de preferință 22 × 22 mm, folosind balsam Canada sau alt mediu de montare.
Nimeni nu a comentat acest articol încă.