imunofluorescență este o tehnică puternică de imunocolorare care folosește anticorpi legați covalent de molecule fluorescente pentru a identifica ținte specifice din probele de celule fixate pe un suport solid.
Această tehnică implică observarea microscopică cu specificitate imunologică, făcând posibilă observarea celulelor vii sau moarte care pot prezenta cantități minuscule de antigeni. Este utilizat pe scară largă atât în domeniul cercetării, cât și în diagnosticul clinic al diferitelor patologii.
Această tehnică, în principal calitativă (cu unele variante cantitative), are legătură în mod specific cu vizualizarea unei probe prin semnalul produsului unui fluorofor, care este o moleculă fluorescentă legată de un anticorp și care poate fi excitată la o anumită lungime de undă. ..
În contextul celular este foarte util să se studieze prezența / absența și localizarea subcelulară a proteinelor. Tehnica a fost utilizată în primele sale perioade clinice pentru diagnosticarea virușilor precum gripa și ulterior pentru multe alte boli infecțioase..
Este o tehnică extrem de sensibilă și, cu echipamentul adecvat de microscopie, poate avea o rezoluție foarte bună. Necesită, pentru observarea sa, utilizarea unor microscoape confocale sau epifluorescente.
Cu toate acestea, în ciuda faptului că este foarte popular, poate prezenta unele probleme importante în ceea ce privește obținerea fluorescenței nespecifice, care generează un anumit „zgomot” de fond, care deseori limitează citirea adecvată a rezultatelor..
Indice articol
Imunofluorescența se bazează pe exploatarea fenomenului biologic al reacției de interacțiune dintre un anticorp și un antigen. Are legătură în mod specific cu vizualizarea sau detectarea acestei reacții prin molecule fluorescente interesante la o lungime de undă specifică.
Un anticorp este o proteină imunoglobulină secretată de celulele B active, care este generată în mod specific împotriva unui antigen, de care se poate lega cu o afinitate și specificitate deosebite. Imunofluorescența folosește imunoglobuline IgG, care sunt solubile în serul sanguin..
Anticorpii sunt molecule de până la 950 kDa compuse din două lanțuri peptidice scurte (ușoare) și două lungi în formă de Y (grele). Atât lanțurile ușoare, cât și cele grele sunt împărțite în două domenii: una variabilă, capabilă să recunoască antigenul și alta constantă sau conservată, caracteristică fiecărei specii..
Antigenii sunt definiți funcțional ca molecule care pot fi recunoscute de un anticorp și sunt în mare parte proteine. Când un animal este expus la un antigen, limfocitele sistemului imunitar sunt activate, producând anticorpi specifici împotriva acestuia și care funcționează ca un sistem de apărare.
Un antigen, cum ar fi o proteină, de exemplu, poate avea mai mult de un epitop sau loc de recunoaștere de către un anticorp, astfel încât serul animalului expus unui antigen poate avea anticorpi policlonali împotriva diferitelor regiuni ale aceleiași proteine..
Imunofluorescența, apoi, exploatează capacitatea unui animal de a produce anticorpi policlonali împotriva unui antigen specific pentru a-l purifica și ulterior pentru a-l utiliza pentru detectarea aceluiași antigen în alte contexte..
Printre coloranții sau moleculele fluorescente cele mai utilizate pentru unele tehnici de imunofluorescență se numără izotiocianatul de fluoresceină (FITC), tetrametilrodamina izotiocianatul-5 și 6 (TRITC), multe cianine precum Cy2, Cy3, Cy5 și Cy7 și coloranții numiți Alexa Fluor®, precum Alexa Fluor®448.
Protocolul de imunofluorescență variază în funcție de mulți factori, cu toate acestea, în termeni generali, cuprinde o secvență liniară de pași constând din:
Pregătirea eșantioanelor va depinde de natura lor și de tipul de experiență care trebuie efectuată. În continuare, va fi explicat cel mai simplu caz, care implică utilizarea celulelor în suspensie..
Celulele în suspensie, adică într-un mediu de cultură lichid, trebuie mai întâi separate de acesta prin centrifugare și apoi trebuie spălate cu o soluție tampon sau "tampon" izosmotic, păstrându-i integritatea.
În mod normal, se utilizează un tampon fosfat-soluție salină cunoscut sub numele de PBS, în care celulele sunt resuspendate și acest amestec este centrifugat din nou pentru a obține celulele libere de mediul de cultură, care poate conține substanțe care interferează..
Lamele utilizate pentru observarea microscopică, unde celulele vor fi fixate ulterior pentru tratamentele corespunzătoare din aval, trebuie, de asemenea, pregătite cu atenție..
Acestea sunt acoperite sau „sensibilizate” cu o soluție de poli-lizină, un polimer sintetic care va acționa ca un „adeziv molecular” între celule și suportul solid, datorită interacțiunii electrostatice dintre sarcinile pozitive ale grupelor lor amino și celule.sarcini negative asupra proteinelor care acoperă celulele.
Acest proces constă în imobilizarea proteinelor găsite în interiorul celulei pentru a păstra intactă locația lor spațială. Moleculele utilizate trebuie să fie capabile să traverseze toate tipurile de membrane celulare și să formeze rețele cu proteine covalente..
Formaldehida și paraformaldehida, glutaraldehida și chiar metanolul sunt utilizate pe scară largă, cu care probele de celule sunt incubate pentru o anumită perioadă de timp și apoi spălate cu o soluție tampon izosmotică.
După fixarea celulelor, acestea continuă să fie atașate la foile sensibilizate anterior cu poli-lizină..
În funcție de tipul de test care se efectuează, va fi necesară permeabilizarea celulelor în studiu sau nu. Dacă ceea ce se caută este cunoașterea localizării, prezenței sau absenței unei anumite proteine pe suprafața celulei, permeabilizarea nu va fi necesară.
Pe de altă parte, dacă doriți să cunoașteți locația unei proteine în interiorul celulei, permeabilizarea este esențială și va consta în incubarea probelor cu Triton X-100, un detergent capabil să permeabilizeze membranele celulare..
Un pas fundamental în toate tehnicile imunologice este blocarea. În această etapă a procedurii, blocarea constă în acoperirea, în foile sensibilizate, a tuturor siturilor cu molecule de poli-lizină la care celulele nu au aderat. Adică împiedică orice unire nespecifică.
În mod normal, pentru soluțiile de blocare cu albumină serică bovină (BSA) în tampon PBS se utilizează și se obțin cele mai bune rezultate cu cât timpul de incubație este mai mare cu această soluție. După fiecare pas, inclusiv blocarea, este necesar să spălați soluția rămasă..
Procedura de imunocolorare sau imunocolorare va depinde în principal de faptul dacă este o imunofluorescență directă sau indirectă (vezi mai jos)..
Dacă este o imunofluorescență primară sau directă, probele vor fi incubate cu anticorpii doriți, care trebuie cuplați cu coloranții fluorescenți. Procedura de incubație constă în efectuarea unei diluții a anticorpului într-o soluție care va conține și BSA, dar într-o proporție mai mică.
Atunci când cazul este imunofluorescențial secundar sau indirect, trebuie efectuate două incubații consecutive. Mai întâi cu anticorpii doriți și apoi cu anticorpii capabili să detecteze regiunile constante ale imunoglobulinelor primare. Acești anticorpi secundari sunt legați covalent de fluorofori..
Tehnica este foarte versatilă, permițând marcarea simultană a mai multor antigeni pe probă, atâta timp cât există anticorpi primari cuplați la fluorofori diferiți, în cazul imunofluorescenței directe..
Pentru marcarea simultană în imunofluorescență indirectă, este necesar să se asigure că fiecare anticorp primar este produs la un animal diferit, precum și că fiecare anticorp secundar este cuplat la un fluorofor diferit..
La fel ca blocarea, incubația cu anticorpi oferă rezultate mai bune cu cât timpul de incubație este mai mare. După fiecare etapă este necesar să se spele excesul de anticorpi care nu s-au legat de probe și în imunofluorescența secundară este necesar să se blocheze înainte de a adăuga anticorpul secundar.
Anumite tehnici folosesc alte pete care nu au legătură cu imunomarcarea, cum ar fi colorarea ADN-ului nuclear cu fluoroforul DAPI..
În timpul incubării finale cu fluorofori este necesar ca probele să rămână în întuneric. Pentru observarea microscopică, este obișnuit să se utilizeze unele substanțe pentru a păstra fluorescența fluoroforilor cuplați la anticorpi..
Are legătură cu detectarea antigenelor prin utilizarea anticorpilor fluorescenți. Principalul avantaj al utilizării acestei tehnici este viteza sa, cu toate acestea, multe cazuri de legare nespecifică pot apărea în acest proces, în special atunci când se studiază serurile umane, deoarece acestea sunt bogate în anticorpi foarte eterogeni..
Este, de asemenea, cunoscut sub numele de tehnica „sandwich” și aceasta implică dezvoltarea tehnicii în doi pași. Primul are legătură cu utilizarea unui anticorp non-fluorescent și legarea acestuia la antigenul de interes..
Împotriva regiunii constante a acestui prim anticorp (care va servi acum ca antigen) este utilizat un al doilea anticorp capabil să recunoască acesta, care este asociat cu o moleculă fluorescentă.
Apariția unui semnal fluorescent va fi rezultatul recunoașterii specifice între primul anticorp non-fluorescent și antigenul de interes; prezența acestui prim anticorp îl determină pe cel de-al doilea, care este marcat și datorită căruia poate fi determinată prezența sau absența antigenului.
În ciuda faptului că este o tehnică mult mai consumatoare de timp decât imunofluorescența directă (deoarece include încă o etapă de incubație), această tehnică nu implică proiectarea unui anticorp fluorescent pentru fiecare antigen studiat, ceea ce are ca rezultat, din punct de vedere economic, mai viabil.
Mai mult, este o tehnică mai sensibilă în ceea ce privește amplificarea semnalului, deoarece mai mult de un anticorp secundar se poate lega de regiunea constantă a anticorpului primar, amplificând astfel intensitatea semnalului fluorescent..
Așa cum s-ar fi putut observa anterior, imunofluorescența este o tehnică extrem de versatilă, căreia i sa acordat o multitudine de utilizări în domeniul științific și clinic. Poate fi folosit pentru a răspunde la întrebări ecologice, genetice și fiziologice referitoare la multe organisme.
Printre aplicațiile clinice, este utilizat pentru diagnosticarea directă a unor boli dermatologice, fie utilizând imunofluorescența directă sau indirectă pe țesutul epitelial al pacienților studiați..
Tehnicile de imunofluorescență au fost disponibile în organismele unicelulare, cum ar fi drojdia, pentru a vizualiza microtubulii intranucleari și citoplasmatici, actina și proteinele asociate, filamentele de 10 nm și alți constituenți ai citoplasmei, membranei și pereților celulari..
Nimeni nu a comentat acest articol încă.