Löwenstein-Jensen medium este un mediu solid selectiv pentru izolarea și dezvoltarea bacteriilor din genul Mycobacterium, cum ar fi Mycobacterium tuberculosis, M. avium, printre altele, cu excepția speciei leprae, care nu este cultivabilă.
Bacteriile din genul Mycobacterium nu cresc în medii de cultură convenționale, prin urmare a fost necesar să se proiecteze un mediu special pentru izolarea lor. Suportul original a fost creat de Löwenstein și ulterior modificat de Jensen.
Modificarea a constat în eliminarea colorantului roșu din Congo, înlocuindu-l cu o concentrație mai mare de verde de malachit. De asemenea, a modificat concentrațiile de citrat de magneziu și fosfat monopotassic.
Mediul Löwenstein-Jensen conține în prezent amidon de cartofi, asparagină, citrat de magneziu, fosfat monopotassic, sulfat de magneziu, verde de malachit, acid nalidixic, cicloheximidă, lincomicină, ouă bătute, glicerină și apă..
Micobacteriile sunt în mod normal izolate de site-uri care nu sunt sterile, cum ar fi spută, urină, abcese, printre altele. Aceasta înseamnă că majoritatea probelor vor conține microbiota obișnuită a zonei, plus agentul patogen..
De aceea, mediul Löwenstein-Jensen conține o serie de inhibitori în compoziția sa reprezentată de verde de malachit, antibiotice și antifungice..
În plus, probele care provin din situri nesterile trebuie decontaminate și neutralizate înainte de a fi însămânțate pe mediu Löwenstein-Jensen.
Indice articol
Prezența oului și glicerinei în mediul Löwenstein-Jensen stimulează creșterea micobacteriilor deoarece acestea furnizează acizii grași și proteinele necesare dezvoltării acestor microorganisme..
Mediul Löwenstein-Jensen conține verde de malachit, care este un inhibitor al microbiotei însoțitoare. Dar conține, de asemenea, acid nalidixic (35 µg / mL), care inhibă microbiota Gram negativă, cicloheximidă (400 µg / mL), care inhibă ciuperci și drojdii saprofite și lincomicină (2 µ / mL), care inhibă microbiota Gram pozitivă.
Unele companii comerciale preferă să adauge următoarea combinație de antibiotice: polimixină B 200.000 unități / L, amfotericină B 10 mg / L, carbenicilină 50 mg / L și trimetoprim 10 mg / L.
Acest mediu nu conține agar, prin urmare solidificarea mediului are loc datorită coagulării albuminei prezente în ou în timpul sterilizării..
Se cântăresc 37,3 g de mediu deshidratat în 600 ml apă distilată la care s-au adăugat anterior 12 ml glicerol. Amestecul este încălzit, amestecând frecvent până se dizolvă complet. Autoclavează mediul la 121 ° C timp de 15 minute.
Pe de altă parte, o suspensie omogenă de 1000 ml de ouă proaspete trebuie preparată în condiții aseptice. Adăugați suspensia de ou la 600 ml de mediu preparat la o temperatură de 50 - 60 ° C, evitând bulele de aer.
Soluțiile antibiotice sunt adăugate și după autoclavare..
Se toarnă mediul în eprubete sterile cu șurub. Încălziți tuburile la 85 ° C timp de 45 de minute într-o poziție înclinată..
Culoarea mediului preparat este verde acvamarin și poate prezenta pete albicioase datorită prezenței lipidelor din ouă..
PH-ul mediului trebuie să fie de 7,2 ± 0,2
Păstrați tuburile la frigider și protejați-le de lumina directă până la utilizare. Se temperează înainte de semănat.
Există o modificare a mediului numită „Modificare de tip„ Luptă ”a Löwenstein Jensen”. Acesta conține aceiași compuși ca mediul clasic, dar se adaugă ARN-5mg / 100 ml și, ca inhibitori, conține verde malachit 0,025 g / 100 ml, penicilină 50 U / ml și acid nalidixic 35 ug / ml..
Mediul Löwenstein-Jensen este utilizat pentru izolarea micobacteriilor din diferite tipuri de probe. O pată Ziehl-Neelsen este recomandată pentru orice specimen în care se suspectează prezența micobacteriilor..
Unele probe provin din situri sterile, dar altele nu. Probele nesterile trebuie decontaminate după caz:
Probele de spută trebuie decontaminate după cum urmează: determinați cantitatea de probă de spută în ml și adăugați aceeași cantitate de 4% NaOH în probă și incubați la 37 ° C.
Agitați frecvent amestecul pe o perioadă de 30 de minute. Ulterior centrifugați la 3000 RPM timp de 30 de minute.
Aruncați supernatantul peste o soluție dezinfectantă fenolică. Utilizați sedimentul pentru însămânțare, dar mai întâi pH-ul trebuie neutralizat.
Pentru a neutraliza sedimentul, HDouăSW4 5% în prezența indicatorului roșu fenol până atinge un pH neutru care produce o culoare somon.
În acest caz, proba trebuie centrifugată la 3000 RPM timp de 30 de minute. Supernatantul este aruncat și se folosește peleta. Pentru a decontamina sedimentul, adăugați 3 ml de NaOH 4% și amestecați frecvent la 37 ° C pentru o perioadă de jumătate de oră..
Centrifugați din nou, supernatantul este aruncat și peleta este utilizată. Acesta din urmă trebuie neutralizat așa cum se explică în proba de spută..
Lăsați proba să se depună la frigider timp de 24 de ore. Separați supernatantul. Peleta rămasă trebuie centrifugată timp de 30 de minute la 3000 RMP. Aruncați din nou supernatantul și reconstituiți peleta cu 3 ml de soluție fiziologică sterilă..
Se adaugă 3 ml NaOH 4% și se trece la decontaminare și neutralizare așa cum s-a descris anterior..
În acest tip de probă este centrifugată și supernatantul este aruncat. Efectuați un gram pe sediment sau observați direct la microscop; Dacă nu se observă bacterii, etapa de decontaminare nu este necesară, nici etapa de neutralizare.
În acest caz, proba poate fi semănată direct folosind sedimentul. Dacă există bacterii, procedați la decontaminare și neutralizare așa cum este descris mai sus..
La acest tip de probă, trebuie adăugați 5 ml de apă distilată la centrifugarea ulterioară la 1500 RPM timp de 10 minute. Aruncați supernatantul și recentrifugați peleta la 3500 RPM timp de 30 de minute. Utilizați sedimentul pentru a semăna mediul de cultură.
Tamponul trebuie plasat într-un tub steril care conține părți egale apă distilată și 4% NaOH. Tamponul trebuie apăsat pe pereții tubului, astfel încât proba să fie diluată în lichid. Centrifugați și utilizați sedimentul. Neutralizați sedimentul așa cum s-a descris deja.
Mediul Löwenstein-Jensen este inoculat prin adăugarea a 0,5 ml de probă pe suprafața mediului. Rotiți tubul pentru a distribui proba pe mediu. Nu utilizați mâner de platină.
Un al doilea tub poate fi însămânțat care conține mediu Stonebrink în scopul izolării Mycobacterium bovis și alte specii care nu cresc în mediul Löwenstein-Jensen.
Tuburile inoculate sunt incubate aerob la 37 ° C, cu capacul ușor slăbit și înclinat la aproximativ 5 ° și protejat de lumină. Mediul poate fi îmbogățit cu 5-10% dioxid de carbon. Verificați culturile de două ori pe săptămână până când apar colonii.
Când proba a fost absorbită, capacele sunt strânse. Timpul maxim de incubație este de 8 săptămâni, dacă după acest timp nu există creștere, este raportat ca fiind negativ.
Următoarele tulpini pot fi utilizate ca control al calității:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045
Se așteaptă o dezvoltare excelentă pentru primele trei specii menționate, pentru M. fortuitum creșterea trebuie să fie bună, în timp ce pentru M. bovis se așteaptă o creștere mică sau deloc. Întrucât, alte specii decât genul Mycobacterium trebuie să fie complet inhibate.
Mediul pregătit trebuie protejat de lumină, expunerea prelungită la lumină face ca mediul să se transforme din verde în albastru, în acest caz mediul nu mai poate fi utilizat. Acest lucru se datorează faptului că verdele malachit este fotosensibil..
Mediul, deoarece conține ouă, poate fi ușor contaminat dacă nu este manipulat aseptic. Poate fi dizolvat dacă este contaminat cu bacterii proteolitice.
Cultivarea și manipularea bacteriilor din genul Mycobacterium necesită personal calificat care este conștient de măsurile de biosecuritate care trebuie urmate pentru a evita contaminarea sau contaminarea altora..
HCI nu trebuie utilizat în etapa de neutralizare datorită formării clorurii de sodiu, care poate fi toxică pentru bacilul lui Koch..
Probele trebuie păstrate la frigider și protejate de lumină în timp ce nu sunt procesate..
Nimeni nu a comentat acest articol încă.