ADN recombinant (ADNr sau ADNr) este o moleculă de acid nucleic artificial creată în laborator prin integrarea segmentelor de interes din două organisme. Este, de asemenea, cunoscut sub numele de ADN himeric, datorită proprietății sale hibride. Acest tip de ADN nu se găsește în natură.
Metodologia de bază pentru a-l genera include: (a) selectarea unui ADN țintă și inserarea acestuia într-un alt fragment de ADN (în general o plasmidă bacteriană); (b) introducerea acestei plasmide într-o bacterie, (c) selectarea bacteriilor prin intermediul antibioticelor și în final (d) expresia genei.
Tehnica profită de un set de enzime care fac posibilă copierea și lipirea unor fragmente specifice de ADN în conformitate cu judecata cercetătorului..
Scopul tehnologiei recombinante este, în majoritatea cazurilor, expresia unei proteine (cunoscută sub numele de proteină recombinantă) dorită de biologul molecular pentru cercetări viitoare sau pentru a crea o proteină cu valoare comercială și terapeutică - cum ar fi insulina umană, de exemplu.
Indice articol
Toate ființele organice pe care le cunoaștem împărtășesc mai multe caracteristici. Una dintre acestea este natura materialului genetic și modul în care sunt produse proteinele - un proces cunoscut sub numele de „dogma” centrală a biologiei moleculare..
Cu excepția câtorva virusuri, toate organismele stochează informații genetice în ADN (acid dezoxiribonucleic), colectate într-un mod foarte compact și organizat în nucleul celulei..
Pentru exprimarea genelor, molecula ADN este transcrisă în ARN mesager, iar acesta din urmă este tradus în limbajul aminoacizilor, elementele constitutive ale proteinelor..
Între anii '70 și '80, biologii moleculari au început să profite de procesele care apar în mod natural în interiorul celulei și au reușit să le extrapoleze la laborator.
În acest fel, o genă de origine animală (o vertebrată, de exemplu) ar putea fi inserată într-un segment de ADN de la o bacterie; sau ADN-ul unei bacterii ar putea fi combinat cu un ADN viral. Astfel, putem defini un ADN recombinant ca o moleculă compusă din ADN din două organisme diferite..
Odată ce această moleculă hibridă sau recombinantă a fost creată, gena de interes este exprimată. Cu cuvântul expresie vrem să ne referim la procesul de translație în proteine.
Un element cheie în dezvoltarea tehnologiei ADN-ului recombinant a fost descoperirea enzimelor de restricție..
Acestea sunt molecule de proteine care prezintă capacitatea de a cliva ADN-ul (nucleaze) în secvențe specifice, servind drept „foarfece moleculare”. Fragmentele generate de aceste enzime se numesc fragmente de restricție.
Enzimele menționate pot produce tăieturi simetrice în secvența țintă (în ambele lanțuri la aceeași înălțime) sau tăieturi asimetrice. Un aspect cheie al acțiunii enzimelor de restricție este că, după clivarea lanțurilor, se obține o „margine liberă”, complementară celeilalte margini tăiate de aceeași enzimă..
Câteva exemple sunt ECOR 1 și Sma 1. În prezent sunt cunoscute și disponibile în comerț peste 200 de tipuri de enzime de restricție..
Pentru a fi util, o foarfecă trebuie să fie însoțită de lipici. Această acțiune de etanșare a ADN-ului (tratată anterior cu enzime de restricție) este efectuată de ligase.
Mai jos vom descrie etapele principale pe care le necesită tehnologia ADN-ului recombinant. Toate sunt efectuate de profesioniști într-un laborator de biologie moleculară.
Înainte de a continua cu protocolul experimental, trebuie să observăm că în biologia moleculară și biotehnologie termenul „clonă” și verbul „clonă” sunt utilizate pe scară largă. Acest lucru ar putea duce la confuzie.
În acest context, nu ne referim la clonarea lui Tot un organism (ca în cazul celebrei oi Dolly, de exemplu), dar la clonarea unui fragment de ADN, care poate fi o genă. Adică, produce multe copii - identice genetic - ale secvenței.
Primul pas este să decideți ce secvență doriți să utilizați. Acest lucru depinde în totalitate de cercetător și de obiectivele muncii sale. Acest ADN trebuie apoi izolat și purificat. Metodele și procedurile pentru a realiza acest lucru depind la rândul lor de corp și țesut.
În general, o bucată de țesut este prelevată și supusă tratamentului într-un tampon de liză cu proteinază K (o enzimă proteolitică) și apoi ADN-ul este extras. Ulterior, materialul genetic este fragmentat în fragmente mici.
După etapele pregătitoare, cercetătorul încearcă să introducă segmentul ADN de interes într-un vector de clonare. De acum înainte vom numi acest segment de ADN ADN alb.
Unul dintre cei mai utilizați vectori într-o plasmidă de origine bacteriană. O plasmidă este o moleculă de ADN circular cu dublu catenar care se găsește în mod natural în bacterii. Ele sunt străine de cromozomul bacterian - adică sunt extracromozomiale și se găsesc în mod natural în acești procarioti.
Elementele de bază ale unui vector sunt: (a) o origine a replicării, care permite sinteza ADN-ului; (b) agent de selecție, care face posibilă identificarea organismelor care transportă plasmida cu ADN-ul țintă, cum ar fi rezistența la un anumit antibiotic; și (c) site-ul multiclonării, unde se găsesc secvențele care vor fi recunoscute de enzimele de restricție..
Primul ADN recombinant de succes din laborator a fost clonat în plasmida pSC101 din bacterie E coli. Conține un site de restricție pentru enzima de restricție EcoRI și o genă de rezistență la antibiotice, pe lângă originea replicării..
Inserarea ADN-ului țintă în plasmidă se realizează folosind instrumentele moleculare ale enzimelor de restricție și ale ligazelor descrise în secțiunea anterioară..
În plus față de plasmide, ADN-ul poate fi inserat într-un alt vector, cum ar fi bacteriofagul lambda, cosmidele, YAC (cromozomii artificiali de drojdie), BAC (cromozomii artificiali bacterieni) și fagemidele..
Odată ce molecula de ADN recombinant (gena de interes pentru plasmidă sau alt vector) a fost obținută, aceasta este introdusă într-o gazdă sau un organism gazdă, care poate fi o bacterie..
Pentru a introduce ADN străin într-o bacterie, se folosește o tehnică numită transformare bacteriană, în care organismul este supus unui tratament cu cationi divalenți care îl face susceptibil la absorbția ADN-ului..
Metodologic, nu putem garanta că 100% din bacteriile din cultura noastră au preluat în mod eficient molecula noastră de ADN recombinant. Aici intră în joc porțiunea de plasmidă care conține rezistență la antibiotice..
Astfel, bacteriile care au preluat plasmida vor fi rezistente la un anumit antibiotic. Pentru a le selecta, va fi suficient să aplicați antibioticul respectiv și să luați supraviețuitorii.
După selectarea bacteriilor cu ADN-ul nostru recombinant, continuăm să folosim echipamentul enzimatic al gazdei pentru a genera produsul proteic de interes. Pe măsură ce bacteriile se reproduc, plasmida este transmisă descendenților lor, deci nu se pierde în timpul divizării..
Această procedură folosește bacteriile ca un fel de „fabrică” de proteine. Mai târziu vom vedea că a fost o procedură foarte relevantă în dezvoltarea tratamentelor medicale eficiente..
Odată ce cultura este gata și bacteriile au produs cantități mari de proteine, celula este lizată sau perturbată. Există o gamă largă de tehnici biochimice care permit purificarea proteinelor în funcție de caracteristicile lor fizico-chimice..
Într-un alt context experimental, este posibil să nu ne intereseze generarea proteinei, ci mai degrabă suntem interesați să obținem secvența ADN în sine. Dacă acesta ar fi cazul, plasmida ar fi utilizată pentru a crea mai multe copii ale fragmentului de interes pentru a avea suficient ADN țintă pentru a efectua experimentele relevante..
Tehnologia ADN-ului recombinant a deschis un număr infinit de posibilități în biologia moleculară, biotehnologie, medicină și alte domenii conexe. Cele mai remarcabile aplicații ale sale sunt următoarele.
Prima aplicație este direct legată de laboratoarele de biologie moleculară. Tehnologia ADN-ului recombinant permite cercetătorilor să înțeleagă funcția normală a genelor, iar proteinele generate pot fi utilizate în cercetări ulterioare..
Proteinele produse folosind procedura ADN-ului recombinant au aplicații în medicină. Două exemple foarte relevante în domeniu sunt insulina umană și hormonul de creștere, care se aplică la pacienții cărora le lipsește această proteină..
Datorită ADN-ului recombinant, aceste proteine pot fi generate fără a fi nevoie să le extragem de la o altă ființă umană, ceea ce reprezintă complicații metodologice suplimentare și riscuri pentru sănătate. Acest lucru a contribuit la îmbunătățirea calității vieții pentru nenumărați pacienți..
Nimeni nu a comentat acest articol încă.